Summary

생물 발광 시스템 비-침략 적 비보에 의해 Murine 호스트에서 Enterohemorrhagic 대장균 식민지의 검출

Published: April 09, 2018
doi:

Summary

Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.

Abstract

Enterohemorrhagic E. 대장균 (EHEC) O157:H7는 foodborne 병원 체는 causesdiarrhea, 출혈 성 대 장 염 (HS), 그리고 hemolytic 신부전 증후군 (HUS), 인간의 창 자 장관에 식민지. EHEC 식민 vivo에서 의 상세한 메커니즘 연구를 모니터링 하 고 계량 EHEC 식민 동물 모델에 필수적 이다. 여기 모니터링 하 고 계량 EHEC 식민지 생활 호스트에서 EHEC에 발광 표현 플라스 미드를 변형 하 여 마우스 EHEC 식민 모델을 설명 합니다. 동물 생물 발광 표시 EHEC로 주사는 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템으로 탐지 하 여 쥐에서 강렬한 발광 신호를 보여줍니다. 후 1, 2 일 게시 감염, 발광 신호 수 여전히 감지할 수 감염 된 동물에서 EHEC 호스트에 적어도 2 일 동안 식민지 건의 하. 우리는 또한 이러한 발광 EHEC ex vivo 이미지에서 맹에 콜론, 특히 마우스 소장을 찾아 보여줍니다. 이 마우스 EHEC 식민 모델 EHEC 식민 메커니즘의 현재 정보를 도구 될 수 있습니다.

Introduction

EHEC O157:H7 설사1, HS2에서3, 오염 된 물 이나 음식을 통해도 급성 신부전4 원인 병원 체 이다. EHEC 병원 성 enterobacterium 이며 인간1의 위장을 colonizes. EHEC 먼저 호스트 창 자 상피 준수 때 그들은 유형 III 분 비 시스템 (T3SS) 분자 주사기는 연결을 유도 하 고 적용을 이후에 병 변 (A/E) effacing 역할을 통해 호스트 세포에 주입 식민 요인 접착 (식민)5. 이 유전자는 A/E 병 변 형성에 관여 enterocyte 항목 (리) pathogenicity 섬5의 소재 시로 인코딩됩니다.

생물 발광은 빛 생산 화학 반응, 어떤 luciferase catalyzes 보이는 빛6를 생성 하는 기판 소. 이 효소 과정은 종종 산소 또는 아데노신 3 인산 염 (ATP)6의 존재를 필요로 한다. 생물 발광 영상 (BLI) 연구원 시각화 및 호스트 병원 체 상호 작용의 양자화에에서 있습니다 라이브 동물7. 씨 수 있습니다 그들은 이주와 다른 조직7; 침략 발광 박테리아에 따라 살아있는 동물에서 세균 감염 사이클 특성을 이 감염의 동적 진행을 보여준다. 또한, 동물에서 세균 부하는 관련이 발광 신호8; 따라서, 그것은 간단 하 고 직접적인 방법으로 실험 동물의 병 적인 상태를 추정 하는 편리한 표시기입니다.

여기에 사용 되는 플라스 미드 포함 luciferase 오 페론, luxCDABE, 박테리아 자체 luciferase 기판7,9인코딩하는 Photorhabdus luminescens 에서. 이 luciferase 표현 플라스 미드 박테리아로 변형 하 여 살아있는 동물에서 이러한 발광 박테리아를 관찰 하 여 식민과 감염 프로세스를 모니터링할 수 있습니다. 전반적으로, 씨 및 생물 발광 표시 된 박테리아 세균 숫자 및 위치, 항생제/치료 치료와 감염/식민지6, 에 세균성 유전자 발현 세균 생존 능력을 감시 하는 연구자 수 7. 수많은 병원 성 박테리아는 감염에서 감염 주기 및/또는 유전자 표현 검토 하 luxCDABE 오 페론 표현 보고 되었습니다. Uropathogenic 대장균10, EHEC8,11,,1213, enteropathogenic를 포함 하 여 이러한 박테리아 대장균 (EPEC)8, Citrobacter rodentium14,15, 살 모 넬 라 typhimurium16, Listeria monocytogenes17, Yersinia enterocolitica18,19, 비 브리 오 cholerae20, 문서화 되었습니다.

몇 가지 실험 모델 EHEC 식민 생체 외에서 그리고 vivo에서21,,2223의 연구를 촉진 하기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 공부 하기는 EHEC 식민 vivo에서, 적당 한 동물 모델의 부족 및 따라서 내용의 결과 소수 있다. EHEC 식민 메커니즘에는 vivo에서의 연구를 촉진 하기 위하여 관찰 하 고 계량 비-침략 적 방법에서 살아있는 동물에서 EHEC 식민 동물 모델을 구축 하는 귀중 한입니다.

이 원고는 EHEC 식민 생활 호스트에 시간이 지남에 따라 모니터 발광 표현 시스템을 사용 하는 마우스-EHEC 식민 모델을 설명 합니다. 마우스는 intragastrically 생물 발광 표시 EHEC로 접종 하 고 발광 신호는 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템13와 쥐에서 발견 되. 마우스 감염 생물 발광 표시 EHEC 2 일 게시 감염 후 2 일 게시 감염 호스트 창에 그 박테리아 식민지는 제안 후 그들의 내장에서 중요 한 발광 신호를 보여주었다. 이미지 데이터 비보 전 이 식민은 맹 쥐의 콜론에서 구체적으로 보여주었다. 이 마우스 EHEC 모델을 사용 하 여 발광 EHEC 식민 검출 될 수 있다 살아있는 호스트에는 vivo에서 이미징 시스템에서 더 이해를 증진 수 있습니다 장의 박테리아 식민지의 상세한 메커니즘을 연구 하 여 EHEC 유도 생리와 병리학 변화입니다.

Protocol

주의: EHEC O157:H7는 biosafety 수준 2 (BSL-2) 병원 체 질병 통제 및 예방 (CDC) biosafety 지시 (https://www.cdc.gov/)를 위한 센터에 따르면. 따라서, 모든 실험 절차 관련 된 EHEC BSL-2 시설에서 수행 되어야 합니다. 실험을 수행 하는 동안 실험실 코트와 장갑 착용. 인증된 biosafety 내각 (BSC)에서 작동 합니다. 70% 에탄올과 실험 절차 전후 실험 벤치를 소독. 모든 악기 또는 장비 연락처 (또는 잠재적으로 연락처) EHEC 70%…

Representative Results

우리는 생물 발광 표시 EHEC 관리 (~ 109 세균성 세포) 구강에 의해 6 주 오래 된 여성 C57BL/6 마우스. 1 시간 이내 쥐 EHEC의 구두 접종 후 동물 vivo에서 이미징 시스템 그림 7과 같이 발광 신호 위해 시험 되었다. 결과 생물 발광 표시 EHEC와 gavage 쥐에서 강한 발광 신호를 보여주었다. 우리는 2 일 게시물 감염에 신호를 검사합니다. <strong class="x…

Discussion

그것은 알려졌다 EHEC luciferase 플라스 미드와 변환 호스트 또는 유전자 식 vivo에서8,,1112에 그것의 지역화를 검사 활용 되었습니다. 여기 시연 murine 모델 또한 murine 호스트8에서 EHEC 식민지 시기와 지역화를 검색 하기 위해 보고 되었다. 그럼에도 불구 하 고, 우리는 intragastrically 마우스 EHEC 접종을 관리 하…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리는 인정 하는 치 정 첸에서 학과의 의료 연구, 치 매 의료 센터 (타이난, 대만), 감염 및 국립 쳉 쿵 대학 실험실 동물 센터에서 지원에 마우스에 도움. 이 작품은 과학의 성직자에 의해 지원 하 고 기술 (대부분) CC를 (가장 104-2321-B-006-019, 105-2321-B-006-011, and106-2321-B-006-005)를 부여 합니다.

Materials

Shaker incubator YIH DER LM-570R bacteria incubation 
Orbital shaking incubator FIRSTEK S300 bacteria incubation 
pBSL180 source of nptII gene
pAKlux2 source of luxCDABE operon
T&A Cloning Kit Yeastern Biotech FYC001-20P use for TA cloning 
Nsi I NEB R0127S use for plasmid cloning 
Sca I NEB R0122S use for plasmid cloning 
Spe I-HF NEB R0133S use for plasmid cloning 
Sma NEB R0141S use for plasmid cloning 
T4 ligase NEB M0202S use for plasmid cloning 
Ex Taq TaKaRa RR001A use for PCR amplification
10X Ex Taq Buffer TaKaRa RR001A use for PCR amplification
dNTP Mixture  TaKaRa RR001A use for PCR amplification
PCR machine applied Biosystem  2720 thermal cycler   for PCR amplification
Glycerol SIGMA G5516-1L use for bacteria stocking solution
NaCl Sigma 31434-5KG-R chemical for making LB medium, 10 g/L
Tryptone CONDA pronadisa Cat 1612.00 chemical for making LB medium, 10 g/L
Yeast Extract powder Affymetrix 23547-1 KG chemical for making LB medium, 5 g/L
Agar CONDA pronadisa Cat 1802.00 chemical for making LB agar
kanamycin  Sigma K4000-5G antibiotics, use for seleciton
streptomycin  Sigma S6501-100G antibiotics, eliminate the microbiota in mice
EDL933 competent cell Homemade method is on supplemental document 
Electroporator MicroPulser for electroporation
Electroporation Cuvettes Gene Pulser/MicroPulser 1652086 for electroporation
High-speed centrifuge Beckman Coulter Avanti, J-26S XP use for centrifuging bacteria 
Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter JA25.5 use for centrifuging bacteria 
Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter JLA10.5 use for centrifuging bacteria 
centrifuge bottles Beckman Coulter REF357003 use for centrifuging bacteria 
centrifuge bottles Thermo Fisher scientific 3141-0500 use for centrifuging bacteria 
eppendorf biophotometer plus  eppendorf AG 22331 hamburg for measuring the OD600 value of bacteria
C57BL/6 mice  Laboratory Animal Center of NCKU
lab coat, gloves for personnel protection 
isoflurane  Panion & BF Biotech Inc. G-8669 for mice anesthesia, pharmaceutical grade
1ml syringe  use for oral gavage of mice
Reusable 22 G ball-tipped feeding needle φ0.9 mm X L 50 mm use for oral gavage of mice
surgical  scissors  use for mice experiment
Xenogen IVIS 200 imaging system Perkin Elmer IVIS spectrum use for bioluminescent image capture 
Living Image Software Perkin Elmer version 4.1 use for quantifying the image data

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Citar este artigo
Kuo, C., Wang, S., Chen, C. Detection of Enterohemorrhagic Escherichia Coli Colonization in Murine Host by Non-invasive In Vivo Bioluminescence System. J. Vis. Exp. (134), e56169, doi:10.3791/56169 (2018).

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