我们提供简单而强大的方法来处理各种物种的活检材料,生物医学模型生物的胚胎和其他有机组织的样品,以便通过高分辨率显微镜显微镜方法生成数字体积数据。
我们提供使用高分辨率显微镜(HREM)方法生成数字体积数据的简单协议。 HREM能够在1 x 1 x 1和5 x 5 x 5μm3之间的典型数字分辨率下对体积高达5 x 5 x 7 mm 3的有机材料进行成像。将样品嵌入甲基丙烯酸酯树脂中并切片在切片机上。在每个部分之后,使用位于连接到复合显微镜头的光电管上的数字摄像机捕获块表面的图像。光轴穿过绿色荧光蛋白(GFP)过滤器立方体,并与每个部分后方的保持架臂静止的位置对齐。以这种方式,产生一系列固有对准的数字图像,显示后续的块表面。在三维(3D)可视化软件中加载这样的图像系列有助于立即转换为允许虚拟的数字卷数据在各种正交和倾斜平面中进行激励,并创建体积和表面渲染的计算机模型。我们提出三种简单的组织特异性方案,用于处理各种有机标本,包括小鼠,小鸡,鹌鹑,青蛙和斑马鱼胚胎,人体活检材料,未涂布纸和皮肤替代材料。
有机和无机材料的结构分析是理解其物理性能和功能的第一步。这种分析的基础通常是通过仔细观察组织切片获得的二维(2D)信息,具有提取组织结构细胞,细胞形态和拓扑,分子组成和生物力学性质的各种简单和复杂的成像方法1 , 2,3 。然而,2D信息不适合研究空间复杂的布置。因此,在过去几十年中建立了越来越多的允许产生数字体积数据的体内和体外方法,并且还在开发中。
大多数卷数据生成方法的有条理的原则是生成虚拟堆栈数字图像显示通过对象的虚拟或物理分段获得的部分。如果部分图像正确对齐,则会创建一个卷,该卷可以在虚拟剖面中重新划分,或用于创建3D曲面和体绘制模型。用于可视化人类和较大生物样本的流行技术是磁共振断层扫描(MRT),计算机断层扫描(CT),正电子发射断层扫描(PET)和单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。小样本通常使用微磁共振成像(μMRI),光学投影断层扫描(OPT),光学相干断层扫描(OCT),光声层析成像(PAT),基于组织切片的方法,共聚焦显微镜和电子断层扫描显示5,6 , 7,8,9,10 <s, 11,12,13,14,15,16,17 。
产生小标本和组织学样本的数字数据的相对较新的体积数据生成技术是与Tim Mohun 18,19密切合作开发的HREM方法。它是一种简单的基于显微镜的技术,它从在切片机上切片的树脂嵌入材料产生数字体积数据。数据有助于细胞分析和组织结构细胞分布以及中等光学微观层面小特征的度量分析。
HREM生成堆叠的固有对齐的数字图像,似乎从e获取osin染色组织切片。组织对比度和数据分辨率相对于视野超过了用μCT,μMRI和OPT产生的数据,但是低于用共聚焦,光片和电子显微镜可获得的数据。然而,与后者相反,HREM能够使组织学质量中具有高达5×5×7mm 3的相对大体积的样品可视化。一些最近的研究提供了单一成像技术的优点和缺点的详细描述和比较,为了客观性,我们参考有关其局限性和潜在应用领域4,21,22,23 , 24 。
本研究重点介绍HREM成像方法,旨在提供用于生成广谱有机材料的HREM数据的非常简单的方案,以及它们的应用实例。创建HREM数据的工作流程很简单,适用于可嵌入甲基丙烯酸酯树脂的所有材料( 图1 )。然而,样品制备中存在组织特异性差异,需要考虑。因此,我们提供了三种准备各种样品的标准方案。所有嵌入和数据生成协议步骤都是相同的。
HREM是一种高度可靠的微观方法,非常适用于生物医药和工业中使用的广泛有机材料的可视化18,21,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 , 38,39,40 。它可以用作独家成像模式,如目前发展障碍机制(DMDD)计划41,42 <sup> 43,44 ,或作为多模式成像管线45的综合部分。
完整功能的HREM数据生成装置可以由常规实验室部件组装,并且包括电动切片机,显微镜,电动交叉表和具有适当软件的计算机25 。使用配备有块保持器的切片机至关重要,该切片机在定义的位置的每个部分和光学通路中的GFP滤光片之间可重复地停止。然而,全面运作的全包解决方案可以从Indigo Scientific等公司购买。
HREM面临与所有组织学技术相同的限制,除了在切片或切片安装期间不引入人为因素。然而,存在限制,这是由于在切片之前必须染色标本而产生的从嵌入材料的特点。通过整个样品渗透曙红需要获得足够的组织对比度;非常致密的材料,脂肪组织和无机物质有效阻碍曙红渗透,并导致物体中心的未染色组织。使用特殊的固定剂有助于染色皮肤标本,但仍然没有适当的方法来彻底克服这个问题。另一个限制是,在切片过程中阻挡高于2厘米的树脂会破裂。这可以通过单独切割样品和加工部件来部分避免。
在嵌入过程中,将小样本或具有不规则表面的样品正确定位在模具中通常是有问题的。用琼脂糖覆盖样品并按照方案进行处理琼脂糖块通常可以解决这个问题19 。一种替代方法,这也有助于块在组织中断要将其已经硬化的块从其固定器中移除,并按照所述的嵌入程序重新嵌入。
典型的HREM数据集包括500到3000个单个图像。其数值分辨率由连续图像之间的距离( 即 ,通过截面厚度),相机目标的特性和所使用的光学器件的性质决定。我们使用1μm和5μm之间的截面厚度,并取得了很好的效果,尽管提出的协议并不完全消除伪影20,46的光泽。这些伪像是由位于块内深处的强烈染色的组织引起的,导致块表面上的组织信息模糊。
相机的目标尺寸为2,560 x 1,920像素2,2,048 x 2,048像素2和4,096 x 4,096像素2 ,并组合内置1.25X,2.5X,5X,10X和20X物镜。这导致0.18×0.18μm2和5.92×5.92μm2之间的数字像素尺寸,这被证明足以用于组织结构和细胞形状的3D分析,甚至可视化核。鉴于高数字分辨率,其他细胞器也应该可见。由于简单的伊红染色,造成的对比度不足,并且目标的光学性质大大降低了辨别结构的可能性。考虑到数值孔径的HREM数据的最大真实空间分辨率约为1×1×1μm3,因此仅允许有效区分大于3×3×3μm3的结构。
所有数字成像技术的一个常见问题是视野的尺寸之间的折衷,其定义了可以显示的样本的一部分d在相机目标上,以及图像的数字分辨率。视场越大,最大可能的数字分辨率越低46 。这里使用的HREM设置允许生成HREM数据,其视野范围为0.74 x 0.74 mm 2 (20X物镜),数字分辨率为0.18 x 0.18μm2和12.12 x 12.12 mm 2 (1.25X物镜),显示在2.96 x 2.96μm2的数字分辨率。另外,商业化的设置可以提供更大的观点,但以真正的解决为代价。然而,从DMDD程序47的主页上显示的数据显而易见,它们提供了出色的结果。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢Tim Mohun在开发HREM和Petra Heffeter提供样品方面的无价贡献。
JB-4 Plus Embedding Kit | Polysciences Europe GmbH | 18570-1 | includes Benzoyl Peroxide, Plasticized (Catalyst) and Solution A+B |
Polyethylene Molding Cup Trays, 6x8x5mm hexagon (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177A-3 | |
Polyethylene Molding Cup Trays, 13x19x5mm (9 cavities) | Polysciences Europe GmbH | 17177C-3 | |
JB-4 Plastic Block Holders | Polysciences Europe GmbH | 15899-50 | |
Eosin | Waldeck GmbH & Co. KG, Division Chroma | 1A-196 | |
Microtec CUT 4060E | rotary microtome | ||
Leica DM LM, fluorescence compound microscope | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
GFP filter set | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | 11090937180000 | |
Motorised cross table | Walter Uhl, technische Mikroskopie GmbH & CO. KG | KT5-LSMA | |
Digital video camera SPOT-FLEX | Visitron Systems GmbH. | ||
precisExcite High-Power LED | Visitron Systems GmbH. | light source | |
VisiView 2.1.4 | Visitron Systems GmbH. | Image capturing software | |
Hard metal knife (tungsten carbide), profile D | Leica Mikrosysteme Handelges.m.b.H | ||
KL 2500 LCD | Schott AG | light source |