Summary

쥐와 분류 된 그들의 Postsynaptic 밀도 단백질에 변화 발작 유발 검사 Electroconvulsive 발작

Published: August 15, 2017
doi:

Summary

Electroconvulsive 발작 (ECS)는 심한 우울증을 위한 electroconvulsive 치료의 실험 동물 모델. 세계적으로 ECS synaptogenesis 및 시 냅 스가 소성 하는 해 마에서 활동을 자극 한다. 여기, 우리가 쥐에 ECS 유도 및 시 냅 스 단백질에 변화 발작 유발 검사 된 그들의 subcellular 분류 방법을 설명 합니다.

Abstract

Electroconvulsive 발작 (ECS)는 electroconvulsive 치료, 심한 우울증에 대 한 가장 효과적인 치료의 실험 동물 모델. ECS 낮은 사망률과 신경 죽음으로 일반화 된 토 닉 clonic 발작을 유도 하 고 화면 항 간 질 약에 널리 사용 되는 모델 이다. 여기, 우리는 ECS 유도 방법을 설명 간단한 55-mA 전류 0.5에 대 한 전달 되는에서 남성 s 쥐 귀 클립 전극을 통해 무게에 200-250 g. 이러한 양자 자극 생산 단계 4-5 clonic 발작 지속 약 10 s. 급성 또는 만성 ECS의 정지 후 대부분 쥐 행동 구별 되도록 복구 “발작” 쥐 사기. ECS는 세계적으로 두뇌 활동을 끌어올리고, 때문에 그것 또한 활동 종속 변경 시 냅 스 단백질 및 여러 방법을 사용 하 여 시 냅 스 강도에 미치는 영향의 검토에 사용 되었습니다. 특히, 서 부 럽 함께에서 postsynaptic 밀도 (PSD)의 subcellular 분류 전문된이 시 냅 스 구조에서 시 냅 스 단백질의 풍부의 양적 결정 수 있습니다. 설치류 두뇌의 큰 금액을 필요로 하는 이전 분류 방법, 달리 여기 자당 기온 변화도 원심 분리 하지 않고 하나의 쥐의 된에서 PSD를 분리 하는 소규모 분류 방법을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 고립 된 PSD 분수 postsynaptic 막 단백질, PSD95, GluA2, GluN2B, 등을 포함 보여줍니다. 연 접 마커 synaptophysin 및 녹는 세포질 단백질 α-tubulin는 성공적인 PSD 격리를 보여주는 PSD 분수에서 제외 했다. 또한, 만성 ECS GluN2B 식 우리의 소규모 PSD 분류 방법, 약리, 유전 또는 기계적 치료 후 단일 쥐에서 hippocampal PSD 단백질에 변화를 감지에 적용할 수 있습니다 나타내는 PSD에 감소 .

Introduction

Electroconvulsive 치료 심한 약물 내성 우울증, 양극성 우울증, 파 킨 슨 병의 질병, 그리고 정신 분열 증1,2를 포함 하 여 주요 우울증 장애 환자 치료에 사용 되었습니다. 이 치료에서 발작 epicranial 전극1,2,3를 통해 마 취 환자의 머리에 전달 하는 전기 자극에 의해 생성 됩니다. ECS의 반복적인 관리 임상 약물 내성 우울증 장애1,2,3에 도움이 되었습니다. 그러나, 인 간에 있는 항우울제 효과의 장기 효 험 기본 정확한 메커니즘은 애매 남아 있다. ECS는 electroconvulsive 치료의 동물 모델 이며 치료 메커니즘을 조사에 널리 사용 됩니다. 설치류, 급성 ECS와 ECS 치료 만성는 된 성체를 촉진 하 고 신경 네트워크4,5, 재구성 인지 유연성에서 향상에 기여할 것입니다. 또한, ECS에 의해 두뇌 활동의 글로벌 상승 같은 두뇌 파생 neurotropic 요소6, 그리고 여러 단백질, N-메 틸-D-aspartate metabotropic 글루타민 산 염 수용 체 17 등 성적 증명서의 풍부 변경 (NMDA) 형식 글루타민 산 염 수용 체 소 단위7. 이러한 변화는 시 냅 스 번호, 구조, 및 해 마7,,89에서 힘의 장기 수정 중재에서 포함 된다.

ECS 모델에 전기 자극 일반화 된 토 닉 clonic 발작10,11연상 stereotaxically 이식된 전극, 막 전극, 또는 귀 전극을 통해 설치류에 전달 됩니다. 전극의 stereotaxic 주입 뇌 수술을 포함 하 고 상해를 최소화 하기 위해 실험의 수술 능력을 개선 하기 위해 상당한 시간이 필요 합니다. 적은 침략 적인 각 막 전극 각 막 찰과상과 건조를 일으킬 수 있고 마 취 필요. 귀 클립 전극의 사용 때문에 수술이 나 마 취 없이 설치류에 사용 될 수 있는 최소한의 부상의 입을 이러한 제한을 무시 합니다. 사실, 우리 귀 클립 전극을 통해 현재 깨어 배달된 쥐 안정적으로 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 유도 및 변경 된10그들의 시 냅 스 단백질 발견.

ECS 유도 풍요의 설치류의 특정 두뇌 지구에서 시 냅 스 단백질을 검사, 그것은 그들의 탐지 및 정량화에 대 한 가장 적합 한 실험 방법을 선택 하는 것이 중요. 두뇌의 subcellular 분별 녹는 cytosolic 단백질;의 원유 격리에 대 한 허용 막 단백질; 세포 기관이 경계 단백질; 그리고 PSD12,,1314같은 특별 한 subcellular 구조에 단백질. PSD는 신경에 시 냅 스 단백질은 매우 집중에서 그리고 postsynaptic 막12,,1315근처에 있는 조밀 하 고 잘 조직 된 subcellular 도메인. PSD의 풍요로 움과 postsynaptic 글루타민 산 염 수용 체, 비 계 단백질, 및 PSD12 신호 변환 단백질의 기능에 동적 변경 이후는 PSD에 농축 하는 시 냅 스 단백질의 연구에 대 한 유용 , 15 , 16 , 17 시 냅 스가 소성 및 여러 가지 신경 장애17,18에서 관찰 하는 synaptopathy와 상관 있다. PSD를 정화 하는 데 사용 하는 이전 subcellular 분류 방법 자당 기온 변화도14, 의 차등 원심 분리에 의해 두뇌의 원유 막 분수에서 세제 불용 성 분수의 참여 19. 많은 양의 설치류 두뇌14,19요구 한다이 전통적인 방법으로 주요 도전 이다. 격리 치료 당 PSD 분수를 10-20 설치류의 준비 광범위 한 비용 및 시간 투자를 요구 하 고 많은 치료 하는 경우에 실제적으로 가능 하지 않습니다.

이 문제를 극복 하기 위해 우리가 직접 PSD 분수 없이 자당 기온 변화도 원심 분리20,21, 격리 하 고 단일 쥐의 된에서 PSD 격리를 적용할 수 있도록 개정 하는 간단한 방법 적응 두뇌입니다. 우리의 소규모 PSD 분류 방법에 대 한 수익률 2 된, immunoprecipitation 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 포함 하 여 생 화 확 적인 분석 실험에서 사용 하기 위해 충분 한에서 PSD 단백질의 30-50 µ g. 부 럽 (PSD-95) postsynaptic 밀도 단백질 95의 농축 및 연 접 마커 synaptophysin 및 녹는 세포질 단백질 α-tubulin 배제를 공개 하 여 PSD를 고립 시키기를 위한 우리의 방법의 성공을 보여 줍니다. 우리의 ECS 유도 및 소규모 PSD 분류 방법 다른 설치류 뇌 영역에 쉽게 적응할 수 있으며 PSD 단백질의 표현에 ECS의 효과 평가 하는 비교적 간단 하 고 안정적인 방법을 제공.

Protocol

동물 주제를 포함 하 여 모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 어바나-샴페인 일리노이의 대학에 위원회에 의해 승인 되었습니다. 1. 쥐 식민지를 유지 하 Sprague Dawley 쥐 ( 재료의 표참조)를 번 식 하 고 12-h 빛 어두운 주기와 음식과 물에 대 한 ad libitum 액세스 표준 조건에서 그들을 유지 하는 것. 출생 후 하루 (P) 28에 쥐 새끼를 유아와 2-4 남성 또?…

Representative Results

상세한 절차를 사용 하 여 여기에 제시 된, 전기 충격 (55 mA, 0.5에 대 한 100 펄스/s s) 쥐 (그림 1A-B)에서 4-5 토 닉 clonic 발작 귀 클립 전극 유도 반복 되지 않는 단계를 통해 전달. 쥐의 총 8 급성 ECS 유도 받은 고 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 표시. 발작 지속 약 10 s, 그리고 모든 쥐 발작 정지의 1-2 분 이내 복구. 가짜 “아니 발작” 쥐 전기 충격을 …

Discussion

여기, ECS 유도 하는 방법을 쥐에 그들의 된 신경 활동의 글로벌 자극 elicits 설명 합니다. ECS는 electroconvulsive 치료, 임상 인간1,2,3약물 내 화 우울증 질환을 치료 하는 데 사용 되는 동물 모델입니다. 심한 우울증 치료 electroconvulsive 치료의 사용에도 불구 하 고 정확한 기본 메커니즘 불분명 남아 있습니다. ECS 경우 새로운 조사를 ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자 분류 및 박사 그레이엄 H. Diering 그의 원심 분리기를 사용 하 여 소규모 프로토콜 PSD 분별에 대 한 제공에 대 한 존스 홉킨스 대학에서 박사 리처드 L. Huganir의 실험실에서 수 박사 에릭 C. 볼 턴 감사 합니다.

Materials

Spargue-Dawley rat Charles River Laboratories ECS supplies
A pulse generator Ugo Bsile, Comerio, Italy 57800 ECS supplies
MilliQ water purifying system EMD Millipore Z00Q0VWW Subcellular fractionation supplies
Sucrose Em science SX 1075-3 Subcellular fractionation supplies
Na4O7P2 SIGMA-ALDRICH 221368 Subcellular fractionation supplies
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) SIGMA-ALDRICH E9884 Subcellular fractionation supplies
HEPES SIGMA-ALDRICH H0527 Subcellular fractionation supplies
Okadaic acid TOCRIS 1136 Subcellular fractionation supplies
Halt Protease Inhibitor Thermo Scientific 78429 Subcellular fractionation supplies
NaVO3 SIGMA-ALDRICH 72060 Subcellular fractionation supplies
EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters Fisher Scientific SCGPS05RE Subcellular fractionation supplies
Iris Scissors WPI (World Precision Instruments) 500216-G Subcellular fractionation supplies
30 mm tissue culture dish Fisher Scientific 08-772B Subcellular fractionation supplies
Glass homogenizer and a Teflon pestle VWR 89026-384 Subcellular fractionation supplies
1.7 mL microcentrifuge tube DENVILLE SCIENTIFIC INC.  C2170 (1001002) Subcellular fractionation supplies
Sorvall Legend XT/XF Centrifuge  Thermo Fisher 75004521 Subcellular fractionation supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL Thermo Fisher #23228 Western blot supplies
Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL Thermo Fisher #1859078 Western blot supplies
SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE) BIO-RAD #4561086S Western blot supplies
Running Buffer Made in the lab Western blot supplies. 
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel BIO-RAD #1658004 Western blot supplies
Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane  Milipore IPVH00010 Western blot supplies
Transfer Buffer Made in the lab Western blot supplies. 
Tris-base Fisher Scientific BP152-1 Western blot supplies
Glycine Fisher Scientific BP381-5 Western blot supplies
Sodium dodecyl sulfate SIGMA-ALDRICH 436143 Western blot supplies
Methanol  Fisher Scientific A454-4 Western blot supplies
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 detergent for PSD isolation
Mini Trans-Blot Module  BIO-RAD #1703935 Western blot supplies
Nonfat instant dry milk Great value Western blot supplies
Multi-purposee rotator  Thermo Scientific Model-2314 Western blot supplies
Hyblot CL Autoradiography Film DENVILLE SCIENTIFIC INC.  E3018 (1001365) Western blot supplies
Enhanced chemifluorescence substrate  Thermo Scientific 32106 Western blot supplies
a Konica SRX-101A film processor KONICA MINOLTA SRX-101A Western blot supplies
Name of Antibody
PSD-95 Cell Signaling #2507 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
Synaptophysin Cell Signaling #4329 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
alpha-Tubulin Santacruz SC-5286 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluN2B Neuromab 75-097 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
GluA2 Sigma-aldrich Sab 4501295 Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Rabbit
STEP Santacruz SC-23892 Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 – 12 h, Reaction Temperature = 4 °C, Host Species = Mouse
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoReserch laboratory 715-035-150 Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey
Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoReserch laboratory 711-035-152 Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey

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Citar este artigo
Jang, S., Jeong, H. G., Chung, H. J. Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins. J. Vis. Exp. (126), e56016, doi:10.3791/56016 (2017).

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