madSTORM을 이용한 T 세포의 고해상도 이미징
Summary
우리는 형광 표지 항체의 순차적 인 결합 및 용출을 사용하여 단일 분자 정밀도로 이질적인 나노 구조 내의 다중 분자를 이미지화하는 방법을 시연합니다.
Abstract
단일 분자 위치 결정 현미경을 이용한 이질적인 세포 구조의 영상화는 부적절한 위치 파악 정밀도와 다중화 능력으로 인해 어려움을 겪고 있습니다. 형광 나노 다이아몬드 기준 마커를 사용하여 단일 분자 현지화 현미경에서 높은 정밀도를 얻기 위해 필요한 드리프트 보정 및 정렬 절차를 설명합니다. 또한, 다중 항체 전략 인 madSTORM은 여러 분자가 형광 항체의 순차적 인 결합 및 용출을 이용하여 동일한 세포에서 표적화되는 것으로 기술된다. madSTORM은 활성화 된 T 세포에서 T 세포 수용체 마이크로 클러스터라고 불리는 막 결합 다중 단백질 구조 내 다른 구성 요소의 위치를 시각화합니다. 또한, 다중 단백질 구조의 시각화를위한 일반적인 도구로서 madSTORM의 응용이 논의되었다.
Introduction
광학 현미경 (~ 200 nm)의 회절 한계를 극복하기 위해 다양한 초고 해상도 현미경 기술이 개발되었습니다. 이 중에는 PALM (optical-activation localization microscopy)과 STORM (stochastic optical reconstruction microscopy)이 포함 된 단일 분자 위치 확인 현미경 (SMLM)이라는 기술 범주가 있습니다. SMLM 기술은 on (형광) 상태와 off (dark / photo-switched) 상태 사이에서 전환 할 수있는 형광체의 사용을 공유하므로 단일 분자 1 , 2 , 3 의 형광을 연속적으로 위치시킬 수 있습니다.
시중에서 판매되는 염료 및 현미경과의 호환성으로 인해 직접 STORM (dSTORM)은 널리 채택 된 SMLM 기술입니다. dSTORM은 회절의 중심 계산시 불확실성으로 정의되는 ~ 10 nm의 위치 정밀도를 일상적으로 달성 할 수 있습니다이온 제한점 확산 기능 (PSF). 그러나, 국소화 알고리즘 5 , 6 , 7을 사용하여 추정 된 고정밀도에도 불구하고 단일 분자의 실제 위치를 정확하게 결정하는 데는 많은 문제가있었습니다. 첫째, 이미지 획득 중에 현미경 스테이지의 기계적 움직임은 위치 정밀도에 상당한 불확실성을 추가합니다. 수천 개의 시간 경과 프레임에서 SMLM 이미지가 얻어지기 때문에 현미경 스테이지의 나노 스케일 이동은 최종 초 해상도 이미지의 정밀도를 크게 떨어 뜨릴 수 있습니다. 이미지 획득 중에 스테이지 이동을 보정하기 위해 스테이지 드리프트는 일반적으로 이미지 자체 (교차 상관) 또는 기준 마커 (기준점 보정) 1,9의 순차적 현지화에서 회귀 기반 피팅으로 추정됩니다. 호프이러한 방법은 각 이미지 스택에 대해 여러 매개 변수를 최적화해야하며 기계적 진동과 같은 짧은 시간 범위에서 스테이지 이동을 설명 할 수 없습니다. 금 나노 입자 및 다색 형광 구슬은 SMLM에서 기준 마커로 사용되었지만 광 안정성이 아니므로 드리프트 보정 후 사용 된 질소 공공 중심 형광 나노 다이아몬드 (FND)보다 훨씬 낮은 정확도를 갖습니다. madSTORM 10 .
회절 한계 외에도, 광학 현미경 검사는 스펙트럼 한계에 의해 더 제한됩니다. 여러 대상을 동시에 시각화하려면 일반적으로 형광 기반의 광학 현미경을 6 색으로 제한하고 SMLM을 2-3 색 4 , 11 , 12로 제한하는 비 중첩 스펙트럼 프로파일이있는 형광 프로브가 필요합니다. 더욱이, 비선형 색수차는 다색 이미지의 정렬 불일치를 야기한다.hich는 멀티 컬러 기준 마커 8 , 13을 사용하여 광범위한 정렬 절차가 필요합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 이전의 연구에서는 순차적으로 결합 된 형광체 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19의 반복적 인 photobleaching 또는 chemical quenching을 사용하여 여러 대상을 이미징했습니다. 이러한 방법은 현미경의 스펙트럼 한계를 극복 할 수 있지만, 형광 표백은 유독 한 과정으로 알려져 있으며, 오래 지속되는 표백 또는 담금질은 가교 결합의 손실과 같은 원치 않는 부작용을 유발할 수 있습니다. 또한, 형광 프로브의 축적은 표본에서 결합 부위의 입체적 차단 (steric blocking)을 초래하여 대규모 멀티 플렉스 (multiplexing) 및 에피토프의 견고한 표적화를 방지한다. 이러한 입체적인 간섭을 피하기 위해 최근의tudy는 자유롭게 확산하는 단백질 단편의 확률 적 교환을 이용하여 다중화를 달성했다. 이 방법은 세포 구조의 고밀도 라벨링을 허용하지만, 펩타이드 단편을 분리하기위한 광범위한 생화학 적 준비를 필요로하고, 단일 분자 위치를 찾을 수 없으며 상업적으로 이용 가능한 프로브를 사용하여 대규모 멀티플렉싱을 용이하게하지 못한다. 우리는 멀티플렉싱, 항체 크기 제한 dSTORM (madSTORM) 이미징을위한 형광 항체의 순차적 인 결합 및 용출을 기술하고 정확한 드리프트 보정 및 정렬을 달성하기 위해 형광 나노 다이아몬드를 사용하는 상세한 비디오 프로토콜을 제시합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
madSTORM의 순차 멀티플렉싱, 드리프트 보정 및 정렬 절차를 통해 세포 내 이종 구조의 정밀하고 고도로 다중화 된 시각화가 가능합니다. 또한 madSTORM은 색이 다른 STORM의 제한 사항 (예 : 색수차 및 비 원거리 적색 염료 9 , 12의 최적의 광 스위치 / 방출 특성)을 피합니다. 용출 단계가 순차적으로 결합 된 항체로부터 입체감을 현저히 감소 시킴에 따라 madSTOR…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
STORM 현미경에 대한 액세스를 위해 Xufeng Wu에게 감사드립니다. 이 연구는 국립 암 연구소 (NCI) 암 연구소와 국립 심장 폐 혈액 연구소 (NHLBI)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
Referências
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