Summary

Purificazione del compartimento di membrana per la degradazione del reticolo endoplasmatico-collegata di antigeni esogeni in Cross-presentazione

Published: August 21, 2017
doi:

Summary

Il metodo qui descritto è un nuovo protocollo di isolamento della vescicola, che permette per la purificazione dei compartimenti cellulari dove antigeni esogeni vengono elaborati dal reticolo endoplasmatico-collegata di degradazione in cross-presentazione.

Abstract

Le cellule dendritiche (DCs) sono altamente capace di elaborare e presentare antigeni esogeni interiorizzati su classe di istocompatibilità (MHC) sono molecole conosciuto anche come cross-presentazione (CP). CP svolge un ruolo importante non solo nella stimolazione dell’ingenuo CD8+ T cellule e memoria CD8+ T cellule per infettive e immunità del tumore ma anche nell’inattivazione di self-acting le cellule T naive di anergia delle cellule T o l’eliminazione delle cellule T. Sebbene il meccanismo molecolare critico del CP rimane essere delucidato, raccogliendo la prova indica che antigeni esogeni vengono elaborati tramite associati al reticolo endoplasmatico degradazione (ERAD) dopo l’esportazione da Tronchetti endocitosi scomparti. Fino a poco tempo, caratterizzazioni di questi comparti endocitosi sono stati limitati perché non c’erano specifici marcatori molecolari diversi da antigeni esogeni. Il metodo qui descritto è un nuovo protocollo di isolamento della vescicola, che permette per la purificazione di questi comparti endocitosi. Utilizzando questo microsoma purificato, abbiamo ricostituito il ERAD-come trasporto, ubiquitinazione e l’elaborazione del antigene esogeno in vitro, suggerendo che il sistema ubiquitina-proteasoma elaborato l’antigene esogeno dopo l’esportazione da questo compartimento cellulare. Questo protocollo possa essere applicato ad altri tipi di cella per chiarire il meccanismo molecolare di CP.

Introduction

Il MHC sono molecole sono espresse sulla superficie di tutte le cellule nucleate, con brevi peptidi antigenici derivati da antigeni endogeni, che vengono elaborati dal sistema ubiquitina-proteasoma nel cytosol1. Dopo l’elaborazione, peptidi antigenici sono trasportati nel lume del reticolo endoplasmatico (ER) del trasportatore di peptidi TAP. Nel lume dell’ER, una serie di specifiche chaperoni assistere il caricamento del peptide e il corretto ripiegamento del MHC I complessi. Questa serie di molecole è chiamato il complesso peptide-caricamento (PLC), che indica che l’ER è un vano centrale per peptide caricamento su MHC I2. Dopo peptide di caricamento, il MHC sono molecole vengono trasportati alla superficie delle cellule e svolgono un ruolo chiave nel sistema immunitario adattativo come auto-marcatori e consente il CD8+ linfociti T citotossici (CTL) per rilevare le cellule tumorali o agenti infettivi di antigenica peptidi da proteine non-sé3.

In cellule (APC) presentanti l’antigene, peptidi antigenici da antigeni esogeni sono anche presentata al MHC I4,5,6,7,8 tramite CP, che è trasportato principalmente fuori da DCs9,10,11. CP è essenziale sia per l’attivazione di ingenuo CD8+ T cellule e memoria CD8+ T cells in anti-infettivi e anti-tumorali CTLs12,13e nel mantenimento della tolleranza immunitaria inattivando di self-acting cellule T naive14,15. Il CP svolge molti ruoli importanti nel sistema immunitario adattativo, tuttavia i meccanismi molecolari della CP devono ancora essere descritti dettagliatamente. Gli studi precedenti di CP ha rivelato che antigeni esogeni sono stati localizzati in ER e l’endosoma e sono stati elaborati dal ERAD, suggerendo che antigeni esogeni sono trasportati dall’endosoma al pronto soccorso per ERAD-come elaborazione e peptide caricamento16 . Tuttavia, raccogliendo la prova indica che il caricamento del peptide di CP è effettuato non in ER, ma piuttosto in compartimenti endocitosi non classici, che hanno anche caratteristiche distintive del ER (Figura 1)17,18 ,19,20,21. Per evitare la degradazione dei precursori del peptide antigenico dall’alta attività di aminopeptidasi22 nel citosol, elaborazione e caricamento in CP peptide si verifica nella zona prossimale di questi comparti endocitosi non classici (Figura 1). Anche se le caratterizzazioni di questi comparti endocitosi sono controverse, non ci sono nessun esistenti specifiche molecole diverse da antigeni esogeni in questo comparto.

ERAD è una via cellulare, che in particolare rimuove le proteine misfolded dall’ER. Nella via ERAD, proteine misfolded vengono retrogradely trasportate attraverso la membrana ER al citoplasma ed elaborate dal sistema ubiquitina-proteasoma23,24,25. Quando le molecole di grandi dimensioni, quali le proteine, vengono trasportate attraverso il doppio strato lipidico, queste molecole passano attraverso un apparato molecolare chiamato complesso in un Traslocone, come il complesso di Sec61 e Derlin complesso l’ER26, e il complesso Tom e Tim il i mitocondri27. Quando esogenicamente aggiunto gli antigeni vengono trasportati attraverso la membrana dell’ER, essi devono penetrare bilayer del lipido in complesso con translocons, come il complesso di Sec61. Il metodo qui descritto purificato la vescicola mirata utilizzando queste molecole di membrana-penetrante come marcatori per i compartimenti endocitosi.

Il metodo qui descritto è un nuovo protocollo di purificazione di vescicola utilizzando il DC-come cella linea DC2.428 e biotinilati ovoalbumina (bOVA) come un antigene esogeno. I compartimenti endocitosi sono stati purificati da streptavidina (SA)-biglie magnetiche utilizzando il bOVA membrana-penetrante come un creatore. In questo microsoma purificato, alcuni esogenicamente aggiunto bOVA era ancora conservata nelle frazioni della membrana ma sono stato trasportato all’esterno del microsoma e poi ubiquitinate e trattato in vitro29. Questo microsoma purificata contenuta non solo proteine endocitiche vano, ma anche proteine ER-residente per ERAD e il peptide caricamento complesso; suggerendo che il compartimento cellulare è il vano endocitico prospettico per CP29. Questo protocollo non è dipenda dal tipo di antigeni esogeni e vale anche per altri sottoinsiemi di DC e altri tipi di cellule, quali i macrofagi, linfociti B e cellule endoteliali, per chiarire il meccanismo molecolare preciso di DCs per CP abile.

Protocol

1. crescere cellule e aggiunta di antigeni esogeni preparare bOVA utilizzando un contrassegno di biotina-della proteina kit seguendo il produttore ' protocollo s. Nota: Normalmente, bOVA contiene biotina di 2 M per 1 M OVA mediamente. DC2.4 crescere le cellule in RPMI-1640 completate con 2 mM L-Glutammina, piruvato di sodio di 1 mM, 0,1 mM aminoacidi non essenziali, 100 U/mL penicillina-streptomicina, 55 mM 2-mercaptoetanolo, 10 mM HEPES (pH 7.5) e 10% siero fetale del vitello (d’ora in av…

Representative Results

Per delucidare il meccanismo molecolare di CP, è necessario identificare i compartimenti cellulari, dove antigeni esogeni subiscono ERAD-come trasporto e la lavorazione. Mentre le osservazioni da microscopia di immunofluorescenza o da microscopia elettronica identificato il compartimento cellulare dove antigeni esogeni accumulato16,17,18,19</s…

Discussion

Negli studi precedenti di CP, gli antigeni esogeni incorporati accumulato nell’area riservata del tardo endosoma o ER da microscopia immunofluorescente16,30,31,32. Si stima che ERAD-come trasporto e la lavorazione di antigeni esogeni sono effettuate in queste aree specialistiche dell’ER o endosoma tardivo, come il compartimento cellulare è stato identificato da saccarosio o centrifugazione su …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è supportato da Takasaki Università di salute e del benessere.

Materials

RPMI 1640 gibco by life technologies 11875-093
Fetal bovine serum Equitech bio SFB30
Sodium pyruvate gibco by life technologies 11360-070
MEM non-essential amino acids gibco by life technologies 11140-050
HEPES gibco by life technologies 15630-080
2-mercaptoethanol gibco by life technologies 21985-023
L-glutamine gibco by life technologies 25030-164
Penisicillin-Sreptomycin gibco by life technologies 15140-122
DMEM gibco by life technologies 12100-46
OVA SIGMA A5503
Biotin-protein labelling kit Thermo Fisher Scientific F6347
MG-132  Santa Cruz Biotechnology 201270
lactacystin  SIGMA L6785
Dounce homogenizer IUCHI 131703
protease inhibitor cocktails  SIGMA P8340
iodixanol  Cosmo bio 1114542
SA-magnetic beads  New England Biolabs 201270
control magnetic beads Chemagen M-PVA012
magnetic stand BD Biosciences 552311
BCA protein assay kit Thermo Fisher Scientific 23225
silver staining kits Cosmo bio 423413
Reticulocyte Lysate Promega 1730714
Flag-tagged ubiquitin  SIGMA U5382
anti-ovalbumin (OVA,mouse) Antibody Shop HYB 094-06
ant-multi-ubiquitin (mouse) MBL D058−3
anti-Flag (mouse) SIGMA F3165
trypsin SIGMA 85450C

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Imai, J., Otani, M., Sakai, T., Hatta, S. Purification of the Membrane Compartment for Endoplasmic Reticulum-associated Degradation of Exogenous Antigens in Cross-presentation. J. Vis. Exp. (126), e55949, doi:10.3791/55949 (2017).

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