Isolering av humana myoblaster, bedömning av myogen differentiering och butiksdriven kalciuminmatning
Summary
Här beskriver vi en metod för att erhålla en ren population av humana myoblaster från vuxen muskelvävnad. Dessa celler används för att studera in vitro- skelettmuskeldifferentiering och i synnerhet att studera proteiner som är involverade i Ca 2 + -signaleringen.
Abstract
Satellitceller (SC) är muskelstamceller placerade mellan plasmamembranet i muskelfibrer och den omgivande basala lamina. De är viktiga för muskelregenerering. Vid skada, som uppträder ofta i skelettmuskler, aktiveras SC. De spridas som myoblaster och differentierar för att reparera muskelskador. Bland många händelser som sker under muskeldifferentiering är cytosoliska Ca 2+ signaler av stor betydelse. Dessa Ca2 + -signaler härrör från Ca2 + -frisättning från interna Ca2 + -butiker, såväl som från Ca2 + -inträde från det extracellulära utrymmet, i synnerhet den affärsdrivna Ca 2 + -inmatningen (SOCE). I detta dokument beskrivs en metod som används för att erhålla en ren population av humana myoblaster från muskelprover som samlats in efter ortopedisk kirurgi. Vävnaden smälts mekaniskt och enzymatiskt, och cellerna amplifieras och sorteras därefter genom flödescytometri beroende på närvaron av speciFic membranmarkörer. När de erhållits, expanderas humana myoblaster och engagerar sig för att differentiera genom att avlägsna tillväxtfaktorer från odlingsmediet. Expressionsnivåerna för specifika transkriptionsfaktorer och in vitro immunofluorescens används för att bedöma den myogena differentieringsprocessen i kontrollbetingelser och efter silkning av proteiner involverade i Ca 2 + -signalering. Slutligen beskriver vi användningen av Fura-2 som en ratiometrisk Ca 2+ -prov som ger pålitliga och reproducerbara mätningar av SOCE.
Introduction
Mänskliga skelettmuskler består av grupper av kontraktil multinukleerade muskelfibrer som härrör från fusionen av myogena prekursorceller. Skelettmusklerna har kapacitet att regenerera efter skada tack vare förekomst av SC, skelettmuskelstamcellerna som ligger mellan plasmamembranet av myofibrer (sarcolemma) och basallamina. I oskadad muskel är SCs mestadels närvarande i ett vilande tillstånd. Som svar på mekanisk stress eller skada aktiveras SCs (myoblaster), prolifereras och genomgår antingen differentiering för att bilda nya myofibrer eller självförnyelse för att fylla i SC-poolen 1 , 2 . Under åren har flera tekniker utvecklats för att isolera SC och deras avkomma, myoblasterna, från skelettmuskelbiopsier. Med den större förståelsen av cellytmarkörerna uttryckta på dessa celler och metoden för fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) 3, 4 , 5 , är det nu möjligt att isolera rena populationer av humana myoblaster från muskelprover.
Kalciumsignaleringen reglerar utveckling av skelettmuskler, homeostas och regenerering. I synnerhet är Ca 2 + -posten som aktiveras efter intracellulär lagring, kallad SOCE, av stor betydelse 6 för dessa processer. Vid cellstimulering minskar Ca2 + -nivån i endo / sarkoplasmisk retikulum (ER / SR), som i sin tur aktiverar plasmametall Ca 2+ -kanaler som medger Ca 2+ -tillträde för att fylla på ER / SR 7 . De två huvudproteinerna som är involverade i SOCE är ER / SR Ca2 + -sensingstromal-interaktionsmolekylen 1 (STIM1) -proteinet och plasmamembranet Ca2 + -kanalen Orai1. Skelettmuskel uttrycker i hög grad dessa två proteiner, liksom andra proteiner av samma familjer (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 och flera Ca 2+ -permeabla kanaler i den transienta receptorpotentialkanoniska (TRPC) -familjen 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2+ inträde genom SOCE-vägen är av stor betydelse för muskelbildning / regenerering 14 . Mutationer av STIM1- eller Orai1-proteiner har skadliga effekter på muskelfunktionen, vilket främst leder till muskelhypotoni 15 . Djurmodeller med SOCE-försämring visar också minskad muskelmassa och kraft tillsammans med ökad utmattning 6 , 16 , 17 . Som nämnts uttrycks andra STIM- och Orai-proteiner, liksom många TRPC-kanaler, i skelettmuskler, och deras respektive roller har inte hittills bestämts. Genom att knacka dÄger sin uttrycksnivå, är det således möjligt att undersöka deras konsekvenser i SOCE och deras roller under human skelettmuskeldifferentiering.
SOCE-mätning kan utföras med två olika metoder: elektrofysiologiska ströminspelningar och Ca 2+ mätningar. Elektrofysiologi är verkligen en mer direkt metod, eftersom den mäter aktuell ström och dess associerade elektrofysiologiska signatur. Emellertid är denna teknik mycket svår att applicera på muskelceller, främst på grund av muskelcellernas stora storlek och den lilla storleken hos den endogena SOCE-strömmen. Cytosolisk Ca 2+ bildbehandling är tekniskt mycket tillgänglig, men åtgärden är mer indirekt, eftersom Ca 2+ -nivån uppmätt i cytosolen återspeglar både inmatningen av Ca 2+ och repumpningen ur cellen eller i de interna butikerna.
En metod som inkluderar isolering av myoblaster från små bitar av mänsklig skelEtalmuskel efter enzymatisk uppslutning, förstärkning och FACS förklaras i detta dokument. Processen med muskeldifferentiering och immunofluorescensprotokollet för att följa uttrycket av differentieringsmarkörer över tiden beskrivs 18 . Slutligen förklaras mätningen av SOCE och rollen av olika jonkanaler i Ca 2 + -signalerings- och skelettmuskeldifferentiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isoleringen och kulturen av humana myoblaster från vuxen skelettmuskel erbjuder en in vitro- modell för att studera muskeldifferentiering och muskelregenerering. I det här dokumentet tillhandahåller vi ett protokoll som möjliggör rening av höga utbyten av humana myoblaster på ett enkelt och kostnadsbegränsat sätt. Dessutom ger denna teknik pålitliga och reproducerbara resultat i termer av procentuell andel av myoblaster isolerade och deras myogena differentieringseffe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av den schweiziska National Science Foundation (bidrag nr 310030-166313), "Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", "Stiftelsen Marcel Levaillant" och "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire."
Materials
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 ml tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 ml tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 ml tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. | |||
Referências
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
