Выделение человеческих миобластов, оценка миогенной дифференциации и контроль потребления кальция в магазине

Человеческие скелетные мышцы состоят из групп сократительных, многоядерных мышечных волокон, полученных в результате слияния миогенных клеток-предшественников. Скелетные мышцы способны регенерировать после травмы благодаря наличию SC, стволовых клеток скелетных мышц, расположенных между плазматической мембраной myofibers (сарколеммой) и базальной пластинкой. В неповрежденной мышце SCs в основном присутствуют в спокойном состоянии. В ответ на механические стрессы или травмы SC активируются (миобласты), размножаются и подвергаются либо дифференцировке, либо формируют новые миофибры или самообновление для пополнения пула SC ^{1 , 2} . На протяжении многих лет были разработаны несколько методов для выделения SC и их потомства, миобластов, из биопсий скелетных мышц. С большим пониманием маркеров клеточной поверхности, экспрессируемых на этих клетках, и методологии сортировки клеток, активированной флуоресценцией (FACS) ^{3, 4 , 5} , теперь можно выделить чистые популяции миобластов человека из образцов мышц.

Кальциевая сигнализация регулирует развитие скелетных мышц, гомеостаз и регенерацию. В частности, вход Са ²⁺ , который активируется следующим внутриклеточным истощением магазина, называется SOCE, имеет большое значения ⁶ для этих процессов. При стимуляции клеток, уровень Са ²⁺ в эндо / саркоплазматического ретикулума (ER / SR) уменьшается, что , в свою очередь , активирует плазматической мембраны Ca ²⁺ каналы , которые позволяют вход Ca ²⁺ для пополнения ER / SR ^7. Двумя основными белками, участвующими в СОСЭ, являются белок ERR / SR Ca ²⁺ -центрирующего стромального взаимодействия 1 (STIM1) и канал Ca ²⁺ плазматической мембраны Orai1. Скелетные мышцы обильно выражают эти два белка, а также другие белки одних и тех же семейств (STIM2 aNd Orai2-Orai3) ^{8 , 9} и несколько Ca ²⁺ -проницаемых каналов карионического (TRPC) транзиторного рецепторного семейства ^{10 , 11 , 12 , 13} . Ca ²⁺ через канал SOCE имеет большое значение для мышечного образования / регенерации ¹⁴ . Мутации протеинов STIM1 или Orai1 оказывают вредное воздействие на функцию мышц, что в основном ведет к мышечной гипотонии ¹⁵ . Модели животных с ухудшением состояния окружающей среды также демонстрируют снижение мышечной массы и силы вместе с повышенной утомляемостью ^{6 , 16 , 17} . Как уже упоминалось, другие белки STIM и Orai, а также многие каналы TRPC выражены в скелетных мышцах, и их соответствующие роли пока не определены. Сбив dВладеют своим уровнем экспрессии, поэтому можно исследовать их последствия в SOCE и их роли во время дифференциации скелетных мышц человека.

Измерение SOCE может быть выполнено с использованием двух разных подходов: электрофизиологических записей тока и измерений Ca ²⁺ . Электрофизиология, безусловно, является более прямым методом, поскольку она измеряет текущий интерес и связанную с ним электрофизиологическую подпись. Однако эту технику очень трудно применять к мышечным клеткам, главным образом из-за большого размера мышечных клеток и небольшого размера эндогенного тока СОЭ. Цитозолическое изображение Ca ²⁺ технически очень доступно, но эта мера более косвенная, так как уровень Ca ^2+, измеренный в цитозоле, отражает как вход Ca ^{2+, так} и повторное прокачивание клетки или во внутренних хранилищах.

Методология, которая включает выделение миобластов из мелких кусочков человеческого скеляЭтальной мышцы после ферментативного расщепления, амплификации и FACS объясняется в этой статье. Процесс дифференцировки мышц и протокол иммунофлюоресценции , чтобы следить за экспрессией маркеров дифференцировки с течением времени описаны ^18. Наконец, объясняются измерения SOCE и роли различных ионных каналов в передаче сигналов Ca ²⁺ и дифференцировке скелетных мышц.