인간의 Myoblast의 분리, Myogenic 분화의 평가 및 저장 운영 칼슘 항목 측정
Summary
여기, 우리는 성인 근육 조직에서 인간 myoblasts의 순수 인구를 얻기위한 방법을 설명합니다. 이 세포들은 생체 외 골격근 분화를 연구하고, 특히 Ca 2+ 신호 전달에 관여하는 단백질을 연구하는데 사용됩니다.
Abstract
위성 세포 (SC)는 근섬유의 원형질 막과 주변 기저 층 사이에 위치한 근육 줄기 세포입니다. 그들은 근육 재생에 필수적입니다. 골격근에서 자주 발생하는 부상시 SC가 활성화됩니다. 그들은 근육 아세포로 증식하고 근육 병변을 치료하기 위해 분화합니다. 근육 분화 동안 일어나는 많은 사건 중에서, 세포질 Ca 2+ 신호는 매우 중요합니다. Ca 2+ 신호는 Ca 2+ 가 내부 Ca 2+ 저장소에서 방출 될뿐만 아니라 세포 외부 공간에서 칼슘 2+ 가 들어간 것, 특히 상점 운영 Ca 2+ 입구 (SOCE)에서 발생합니다. 이 논문은 정형 외과 수술 후 수집 된 근육 샘플로부터 인간 근섬유의 순수한 집단을 얻기 위해 사용 된 방법을 설명합니다. 조직은 기계적 및 효소 적으로 소화되며, 세포는 증폭되어 speci의 존재에 따라 유동 세포 계측법에 의해 분류된다fic 막 마커. 일단 얻은 인간의 myoblasts 확장 및 배양 매체에서 성장 인자를 제거하여 차별화에 전념. 특정 전사 인자 및 시험 관내 면역 형광의 발현 수준은 대조 조건 및 Ca 2+ 신호 전달에 관여하는 단백질을 정지시킨 후에 근원적 인 분화 과정을 평가하는데 사용된다. 마지막으로, Fura-2의 비율을 SOC의 신뢰성 있고 재현성있는 측정을 제공하는 비율 계 Ca 2+ 프로브로 사용합니다.
Introduction
인간 골격근은 근원 전구 세포의 융합으로 인한 수축성 다핵 근육 섬유 군으로 구성됩니다. 골격 근육은 근섬유 (원형질막)의 원형질 막과 기저 층 (basal lamina) 사이에 위치한 골격근 줄기 세포 인 SC의 존재로 인해 손상 후 재생성 할 수 있습니다. 손상되지 않은 근육에서 SC는 주로 정지 상태에 있습니다. 기계적 스트레스 나 부상에 반응하여 SC는 활성화되고 (myoblast), 증식하고, SC pool 1 , 2 를 보충하기 위해 새로운 myofibers를 형성하기 위해 분화되거나 자체 갱신됩니다. 수년에 걸쳐 골격근 생검에서 SC 및 그 자손 인 myoblast를 분리하기위한 몇 가지 기술이 개발되었습니다. 이 세포들에 표현 된 세포 표면 마커들과 형광 – 활성화 세포 분류 (FACS) 3 의 방법론에 대한 더 깊은 이해로, 4 , 5 , 이제 근육 샘플로부터 인간 근섬유의 순수 집단을 분리하는 것이 가능합니다.
칼슘 시그널링은 골격근 발달, 항상성 및 재생을 조절합니다. 특히, SOCE라는 세포 내 저장 고갈 다음 활성화되는 칼슘 2 + 항목은 이러한 프로세스에 대한 중요성 6이다. 세포 자극시 endo / sarcoplasmic reticulum (ER / SR)의 Ca 2+ 수준이 감소하고 세포막 칼슘 이온 채널을 활성화시켜 Ca 2+ 유입을 허용하여 ER / SR 7 을 충전합니다. SOCE에 관여하는 두 가지 주요 단백질은 ER / SR Ca 2+ – 감지 간질 상호 작용 분자 1 (STIM1) 단백질과 원형질막 Ca 2+ 채널 Orai1입니다. 골격 근육은이 두 단백질과 같은 가족의 다른 단백질을 풍부하게 표현합니다 (STIM2 and Orai2-Orai3) 8 , 9 및 transient receptor potential canonical (TRPC) 계열 10 , 11 , 12 , 13의 Ca 2+ 투과성 채널. SOCE 경로를 통한 Ca 2+ 유입은 근육 형성 / 재생에 매우 중요합니다 14 . STIM1 Orai1 또는 단백질 돌연변이 근육 긴장 저하 (15)을 중심으로 이어지는 근육 기능에 해로운 영향을 미친다. SOCE 손상이있는 동물 모델은 또한 근육 질량과 힘을 감소시키고, 피로도를 6 , 16 , 17 로 향상시킵니다. 언급 한 바와 같이, 다른 TRP 채널뿐만 아니라 다른 STIM 및 Orai 단백질은 골격근에서 발현되며, 각각의 역할은 지금까지 결정되지 않았다. 노크 d함으로써그들의 발현 수준을 소유하고 있기 때문에 SOCE에서의 함의와 인간 골격근에서의 역할을 조사 할 수 있습니다.
SOCE 측정은 전기 생리 학적 전류 기록과 Ca 2+ 측정의 두 가지 접근법을 사용하여 수행 할 수 있습니다. 전기 생리학은 확실히 현재의 관심과 그에 관련된 전기 생리 학적 신호를 측정하기 때문에보다 직접적인 방법입니다. 그러나,이 기술은 근육 세포에 적용하기가 매우 어렵습니다. 주로 근육 세포의 크기가 크고 내인성 SOCE 전류가 작기 때문입니다. 세포질 칼슘 촬상 기술적으로 매우 접근이지만, 세포질에서 측정 된 Ca2 + 수준의 칼슘의 유입 2+ 및 재 펌핑 셀로부터 또는 내부 저장에 모두 반영 같이 측정은 간접적이다.
인간의 뼈의 작은 조각으로부터 myoblasts를 분리하는 것을 포함하는 방법론효소 소화, 증폭 및 FACS 후 etal 근육이이 종이에 설명되어 있습니다. 시간이 지남에 따라 차별화 마커의 표현을 따르는 근육 차별화 및 면역 형광 프로토콜의 과정은 18 에 설명되어 있습니다. 마지막으로, SOCE의 측정과 칼슘 2 + 신호 및 골격근 분화에 다른 이온 채널의 역할이 설명되어 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성체 골격근으로부터의 인간 myoblasts의 분리 및 배양은 근육 분화 및 근육 재생을 연구하는 in vitro 모델을 제공합니다. 이 논문에서, 우리는 간단하고 비용 – 제한된 방식으로 인간 myoblasts의 높은 수율의 정화를 허용 프로토콜을 제공합니다. 또한,이 기술은 고립 된 myoblasts의 비율과 myogenic 차별화의 효율성 측면에서 신뢰성과 재현성 결과를 제공합니다. 사실, 우리?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (부여 번호 310030-166313), "Fondation Suisse la recherche sur les les maladies musculaires", "Foundation Marcel Levaillant"및 "Fondation pour la recherche ostéo articulaire"에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 ml tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 ml tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 ml tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. | |||
Referências
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