Isolierung von menschlichen Myoblasten, Beurteilung der myogenen Differenzierung und speicherbetriebenen Kalziumeintrittsmessung
Summary
Hier beschreiben wir eine Methodik, um eine reine Population von menschlichen Myoblasten aus erwachsenem Muskelgewebe zu erhalten. Diese Zellen werden verwendet, um die In-vitro- Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen und insbesondere Proteine zu untersuchen, die an der Ca 2+ -Signalisierung beteiligt sind.
Abstract
Satellitenzellen (SC) sind Muskelstammzellen zwischen der Plasmamembran von Muskelfasern und der umgebenden Basallamina. Sie sind für die Muskelregeneration essentiell. Bei Verletzungen, die häufig in Skelettmuskeln auftreten, werden SCs aktiviert. Sie vermehren sich als Myoblasten und differenzieren, um Muskelläsionen zu reparieren. Unter vielen Ereignissen, die während der Muskeldifferenzierung stattfinden, sind zytosolische Ca 2+ -Signale von großer Bedeutung. Diese Ca 2+ -Signale ergeben sich aus der Ca 2+ – Freisetzung aus internen Ca 2+ – Speichern sowie aus dem Ca 2+ – Eintrag aus dem extrazellulären Raum, insbesondere dem speicherbetriebenen Ca 2+ – Eintrag (SOCE). Dieses Papier beschreibt eine Methodik, die verwendet wird, um eine reine Population von menschlichen Myoblasten aus Muskelproben zu erhalten, die nach orthopädischer Chirurgie gesammelt wurden. Das Gewebe wird mechanisch und enzymatisch verdaut, und die Zellen werden amplifiziert und dann nach Durchflusszytometrie nach der Anwesenheit von speci sortiertFische Membranmarker Einmal erhalten, werden menschliche Myoblasten erweitert und verpflichtet, durch die Entfernung von Wachstumsfaktoren aus dem Kulturmedium zu differenzieren. Die Expressionsniveaus spezifischer Transkriptionsfaktoren und in vitro Immunfluoreszenz werden verwendet, um den myogenen Differenzierungsprozess unter Kontrollbedingungen und nach dem Schweigen von Proteinen, die an der Ca 2+ -Signalisierung beteiligt sind, zu bewerten. Schließlich beschreiben wir die Verwendung von Fura-2 als ratiometrische Ca 2+ -Sonde, die zuverlässige und reproduzierbare Messungen von SOCE liefert.
Introduction
Die menschlichen Skelettmuskeln bestehen aus Gruppen von kontraktilen, mehrkernigen Muskelfasern, die aus der Fusion von myogenen Vorläuferzellen resultieren. Skelettmuskeln haben die Fähigkeit, nach Verletzung durch die Anwesenheit von SCs, die Skelettmuskel Stammzellen zwischen der Plasmamembran von Myofasern (Sarkolemma) und der Basallamina zu regenerieren. Im unverletzten Muskel sind die SCs meist in einem Ruhezustand. Als Reaktion auf mechanische Beanspruchung oder Verletzung werden die SCs aktiviert (Myoblasten), proliferieren und unterziehen sich entweder der Differenzierung, um neue Myofasern zu bilden oder sich selbst zu erneuern, um den SC-Pool 1 , 2 wieder aufzufüllen. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Techniken entwickelt, um SCs und ihre Nachkommen, die Myoblasten, von Skelettmuskelbiopsien zu isolieren. Mit dem besseren Verständnis der auf diesen Zellen exprimierten Zelloberflächenmarker und der Methodik der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS) 3, 4 , 5 ist es nun möglich, reine Populationen menschlicher Myoblasten aus Muskelproben zu isolieren.
Calcium-Signalisierung reguliert Skelettmuskelentwicklung, Homöostase und Regeneration. Insbesondere ist der Ca 2+ Eintrag, die folgenden intrazellulären Speicherentleerung aktiviert, SOCE genannt wird , ist von großer Bedeutung , 6 für diese Prozesse. Bei der Zellstimulation nimmt der Ca 2+ -Pegel im endo / sarkoplasmatischen Retikulum (ER / SR) ab, was wiederum Plasma-Membran-Ca 2+ -Kanäle aktiviert, die den Eintritt von Ca 2+ zum Nachfüllen des ER / SR 7 ermöglichen . Die beiden Hauptproteine, die an SOCE beteiligt sind, sind das ER / SR Ca 2+ -sensing stromal Interaktionsmolekül 1 (STIM1) Protein und die Plasmamembran Ca 2+ Kanal Orai1. Skelettmuskel drückt diese beiden Proteine, sowie andere Proteine der gleichen Familien (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 und mehrere Ca 2+ -permeable Kanäle der transienten Rezeptorpotential kanonischen (TRPC) Familie 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2+ Eintritt durch den SOCE-Weg ist von großer Bedeutung für die Muskelbildung / Regeneration 14 . Mutationen von STIM1- oder Orai1-Proteinen haben schädliche Wirkungen auf die Muskelfunktion, was vor allem auf Muskel-Hypotonie 15 führt . Tiermodelle mit SOCE-Beeinträchtigung zeigen auch reduzierte Muskelmasse und Kraft, zusammen mit erhöhter Ermüdbarkeit 6 , 16 , 17 . Wie bereits erwähnt, werden andere STIM- und Orai-Proteine sowie viele TRPC-Kanäle im Skelettmuskel ausgedrückt und ihre jeweiligen Rollen wurden bisher nicht bestimmt. Durch klopfen dBesitzen ihre Ausdrucksstufe, es ist also möglich, ihre Implikationen in SOCE und ihre Rollen während der menschlichen Skelettmuskeldifferenzierung zu untersuchen.
Die SOCE-Messung kann mit zwei verschiedenen Ansätzen durchgeführt werden: elektrophysiologische Stromaufnahmen und Ca 2+ -Messungen. Die Elektrophysiologie ist sicherlich eine direktere Methode, da sie den aktuellen Interesse und die damit verbundene elektrophysiologische Signatur misst. Allerdings ist diese Technik sehr schwierig, auf Muskelzellen anzuwenden, vor allem wegen der großen Größe der Muskelzellen und der geringen Größe des endogenen SOCE-Stroms. Die zytosolische Ca 2+ -Bildgebung ist technisch sehr zugänglich, aber die Maßnahme ist indirekt, da das im Cytosol gemessene Ca 2+ -Gehalt sowohl den Eintritt von Ca 2+ als auch das erneute Pumpen aus der Zelle oder in den internen Geschäften widerspiegelt.
Eine Methodik, die die Isolierung von Myoblasten von kleinen Stücken menschlichen Skels beinhaltetEtal Muskel nach enzymatischen Verdauung, Amplifikation und FACS ist in diesem Papier erklärt. Der Prozess der Muskeldifferenzierung und des Immunfluoreszenzprotokolls, um der Expression von Differenzierungsmarkern im Laufe der Zeit zu folgen, sind beschrieben 18 . Schließlich werden die Messung von SOCE und die Rolle der verschiedenen Ionenkanäle in Ca 2+ -Signalisierung und Skelettmuskeldifferenzierung erläutert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Isolierung und Kultur der menschlichen Myoblasten aus dem erwachsenen Skelettmuskel bietet ein in vitro Modell, um Muskelunterscheidung und Muskelregeneration zu untersuchen. In diesem Papier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das die Reinigung von hohen Erträgen von menschlichen Myoblasten auf einfache und kostenbegrenzte Weise ermöglicht. Darüber hinaus bietet diese Technik zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse in Bezug auf den Prozentsatz der isolierten M…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der Schweizerischen Nationalfonds (Stipendiat 310030-166313), der "Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", der "Stiftung Marcel Levaillant" und der "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire" unterstützt.
Materials
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 ml tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 ml tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 ml tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. | |||
Referências
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
