Isolering af humane myoblaster, vurdering af myogen differentiering og butiksdrevet calciumindgangsmåling
Summary
Her beskriver vi en metode til opnåelse af en ren population af humane myoblaster fra voksen muskelvæv. Disse celler anvendes til at studere in vitro skelettmuskeldifferentiering og især at studere proteiner involveret i Ca 2+ -signalering.
Abstract
Satellitceller (SC) er muskelstamceller placeret mellem plasmamembranen i muskelfibre og den omgivende basale lamina. De er afgørende for muskelregenerering. Ved skader, der forekommer hyppigt i skeletmuskler, aktiveres SC'er. De spredes som myoblaster og differentierer for at reparere muskel læsioner. Blandt mange begivenheder, der finder sted under muskel differentiering, er cytosoliske Ca 2+ signaler af stor betydning. Disse Ca 2+ signaler stammer fra Ca 2+ frigivelse fra interne Ca 2+ butikker såvel som fra Ca 2+ indgang fra det ekstracellulære rum, især den butikbetjente Ca 2+ post (SOCE). I dette papir beskrives en metode, der anvendes til at opnå en ren population af humane myoblaster fra muskelprøver opsamlet efter ortopædkirurgi. Vævet fordøjes mekanisk og enzymatisk, og cellerne amplificeres og sorteres derefter ved flowcytometri ifølge tilstedeværelsen af speciFic membran markører. Når de er opnået, ekspanderes humane myoblaster og engagerer sig i at differentiere ved at fjerne vækstfaktorer fra dyrkningsmediet. Ekspressionsniveauerne af specifikke transkriptionsfaktorer og in vitro immunofluorescens anvendes til at vurdere den myogene differentieringsproces under kontrolbetingelser og efter silencing af proteiner involveret i Ca 2+ -signalering. Endelig beskriver vi brugen af Fura-2 som en ratiometrisk Ca 2+ -probe, som giver pålidelige og reproducerbare målinger af SOCE.
Introduction
Humane skeletmuskler er sammensat af grupper af kontraktile, multinucleerede muskelfibre, der er resultatet af fusion af myogene precursorceller. Skeletmusklerne har kapacitet til at regenerere efter skade takket være forekomsten af SC'er, skeletmuskelstamcellerne ligger mellem myofibers plasmamembran (sarcolemma) og basallamina. I ubeskadiget muskel er SC'er for det meste til stede i en hvilende tilstand. Som reaktion på mekanisk stress eller skade bliver SC'er aktiveret (myoblaster), proliferere og undergår enten differentiering for at danne nye myofibere eller selvfornyelse for at genopfylde SC pool 1 , 2 . Gennem årene blev der udviklet flere teknikker til at isolere SC og deres afkom, myoblasterne, fra skeletmuskelbiopsier. Med den større forståelse af celleoverflademarkørerne udtrykt på disse celler og metoden for fluorescensaktiveret celle sortering (FACS) 3, 4 , 5 , er det nu muligt at isolere rene populationer af humane myoblaster fra muskelprøver.
Calcium signalering regulerer udvikling af skeletmuskel, homeostase og regenerering. Især er Ca 2+ -indgangen, der aktiveres efter intracellulær oplagring, kaldet SOCE, af stor betydning 6 for disse processer. Ved cellestimulering formindsker Ca2 + -niveauet i endo / sarcoplasmisk retikulum (ER / SR), hvilket igen aktiverer plasmamembran Ca 2+ -kanaler, der tillader Ca 2+ -indgang til påfyldning af ER / SR 7 . De to hovedproteiner, der er involveret i SOCE, er ER / SR Ca2 + -sensingstromal interaktionsmolekylet 1 (STIM1) -proteinet og plasmamembranen Ca2 + -kanalen Orai1. Skeletmuskulatur udtrykker i høj grad disse to proteiner samt andre proteiner fra de samme familier (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 og flere Ca 2+ -permeable kanaler i den transiente receptor potentielle canonical (TRPC) familie 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2+ indrejse gennem SOCE-banen er af stor betydning for dannelse / regenerering af muskler 14 . Mutationer af STIM1- eller Orai1-proteiner har skadelige virkninger på muskelfunktionen, hvilket primært fører til muskelhypotoni 15 . Dyremodeller med SOCE-svækkelse viser også reduceret muskelmasse og kraft sammen med forbedret træthed 6 , 16 , 17 . Som nævnt udtrykkes andre STIM- og Orai-proteiner samt mange TRPC-kanaler i skeletmuskel, og deres respektive roller er endnu ikke blevet bestemt. Ved at banke dEjer deres ekspressionsniveau, er det således muligt at undersøge deres implikationer i SOCE og deres roller under differentiering af humane skeletmuskler.
SOCE måling kan udføres ved hjælp af to forskellige metoder: elektrofysiologiske aktuelle optagelser og Ca 2+ målinger. Elektrofysiologi er bestemt en mere direkte metode, da den måler den aktuelle interesse og den tilhørende elektrofysiologiske signatur. Denne teknik er imidlertid meget vanskelig at anvende på muskelceller, primært på grund af muskelcellernes store størrelse og den lille størrelse af den endogene SOCE-strøm. Cytosolisk Ca 2+ billeddannelse er teknisk meget tilgængelig, men målet er mere indirekte, da Ca 2+ niveauet målt i cytosol afspejler både indtrængen af Ca 2+ og repumpningen ud af cellen eller i de interne butikker.
En metode, der omfatter isolering af myoblaster fra små stykker af menneskeskalEtal muskel efter enzymatisk fordøjelse, amplifikation og FACS er forklaret i dette papir. Processen med muskel differentiering og immunofluorescensprotokollen til at følge ekspressionen af differentieringsmarkører over tid er beskrevet 18 . Endelig forklares målingen af SOCE og de forskellige ionkanalers rolle i Ca 2+ signalering og skelettmuskeldifferentiering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Isolationen og kulturen af humane myoblaster fra voksen skeletmuskel tilbyder en in vitro- model til at studere muskeldifferentiering og muskelregenerering. I dette papir giver vi en protokol, der giver mulighed for rensning af høje udbytter af humane myoblaster på en enkel og omkostningsbegrænset måde. Derudover giver denne teknik pålidelige og reproducerbare resultater i forhold til procentdelen af myoblaster isoleret og deres myogene differentieringseffektivi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af det schweiziske nationalfagfonden (tilskud nr. 310030-166313), "Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires", "Stiftelsen Marcel Levaillant" og "Fondation pour la recherche ostéo-articulaire."
Materials
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 ml tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 ml tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 ml tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. | |||
Referências
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
