Tuning i Hippocampal Theta Band<em> In Vitro</em>: Metoder för inspelning från den isolerade gnagare septohippocampalkretsen
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för inspelning av rytmisk neuronalt nätverk theta och gamma-oscillationer från en isolerad hel hippocampalpreparat. Vi beskriver de experimentella stegen från utvinning av hippocampus till detaljer om fält, enhetliga och helcellsplåsterskärmsinspelningar samt optogenetisk stimulering av theta-rytmen.
Abstract
Detta protokoll beskriver förfarandena för beredning och inspelning från den isolerade hela hippocampusen, av WT och transgena möss, tillsammans med senaste förbättringar av metoder och tillämpningar för studiet av theta-oscillationer. En enkel karakterisering av den isolerade hippocampala beredningen presenteras, varigenom sambandet mellan interna hippocampala teta-oscillatorer undersöks tillsammans med pyramidala cellers aktivitet och GABAerga interneuroner, av majs ammoni-1 (CA1) och subikulum (SUB) områden. Sammantaget visar vi att den isolerade hippocampus kan generera inre teta-oscillationer in vitro och att rytmicitet som genereras inom hippocampus kan manipuleras exakt genom optogenetisk stimulering av parvalbumin-positiva (PV) -interuroner. Den in vitro- isolerade hippocampala beredningen erbjuder ett unikt tillfälle att använda samtidiga fält- och intracellulära patch-clampinspelningar från visuellt identifierade neuRons för att bättre förstå mekanismerna som ligger bakom teta rytmgenerationen.
Introduction
Hippokampala tetaoscillationer (4-12 Hz) är bland de mest dominerande formerna av rytmisk aktivitet i däggdjurshjärnan och tros spela nyckelroller i kognitiva funktioner som behandling av spatiotemporala uppgifter och bildande av episodiska minnen 1 , 2 , 3 . Medan flera in vivo- studier som markerar förhållandet mellan theta-modulerade platsceller med rumsnavigations- och lesionsstudier samt kliniska bevis stöder uppfattningen att hippocampala thetaoscillationer är involverade i minnesbildning 4 , 5 , 6 , de mekanismer som är associerade Med generering av hippocampala thetaoscillationer är fortfarande inte fullständigt förstådda. Tidiga in vivo- undersökningar föreslog att thetaaktivitet huvudsakligen berodde på extrinsiska oscillatorer, i synnerhet rytmisk ingångFrån afferenta hjärnstrukturer såsom septum och entorhinal cortex 7 , 8 , 9 , 10 . En roll för inneboende faktorer – intern anslutning av hippocampala neurala nätverk tillsammans med egenskaperna hos hippocampala neuroner – postulerades också baserat på in vitro- observationer 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Men förutom några få landmärkestudier 19 , 20 , 21 , svårigheter att utveckla tillvägagångssätt som skulle kunna replikera fysiologiskt realistiska befolkningsaktiviteter i enkel in vitro- skivberedningS har länge försenat mer detaljerad försöksundersökning av hippocampus och relaterade områdets inbyggda förmåga att själv generera thetaoscillationer.
En viktig nackdel med standard in vitro -tunnskärnings experimentell inställning är att den 3D-cellulära och synaptiska organisationen av hjärnstrukturer vanligtvis kompromissas. Detta innebär att många former av samordnade nätverksaktiviteter baserade på rumsligt fördelade cellaggregat, som sträcker sig från lokaliserade grupper (≤1 mm radie) till populationer av neuroner spridda över ett eller flera hjärnområden (> 1 mm), kan inte stödjas. Med tanke på dessa överväganden behövdes en annan typ av tillvägagångssätt för att studera hur tetaoscillationer uppträder i hippocampusen och sprida sig till relaterade kortikala och subkortiska utgångsstrukturer.
Under de senaste åren har den initiala utvecklingen av "komplett septo-hippocampal" -beredningen för att undersöka tvåriktad interaCtioner av de två strukturerna 22 och den efterföljande utvecklingen av "isolerade hippocampus" -beredningen har visat att intrinsiska tetaoscillationer uppträder spontant i hippocampus som saknar extern rytmisk ingång 23 . Värdet av dessa tillvägagångssätt ligger på den inledande insikten att hela funktionella strukturen i dessa regioner behövdes för att fungera som en teta-rytmgenerator in vitro 22 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Medan elektrofysiologiska inspelningar från akuta hippocampala skivor utgör en standard in vitro- teknik skiljer sig metoderna som presenteras här väsentligen från det klassiska tillvägagångssättet. Till skillnad från de tunna skivberedningarna där specifika cellskikt är synliga vid ytan och kan undersökas direkt, är de intakta hippocampala beredningarna mer besläktade med in vivo- konfigurationer där elektroder sänks ner till riktade hjärnregioner medan de passerar genom enskilda skik…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av de kanadensiska instituten för hälsovetenskap och naturvetenskap.
Materials
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 – sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4X6 inch) | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5x objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40x water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made light-emitting diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
Referências
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function. Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).
- O’Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Winson, J. Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat. Science. 201 (4351), 160-163 (1978).
- M’Harzi, M., Jarrard, L. E. Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats. Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).
- Osipova, D., et al. Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory. J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).
- Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. The significance of the rabbit’s septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).
- Mitchell, S. J., Ranck, J. B. Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats. Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).
- Alonso, A., Garcia-Austt, E. Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials. Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).
- Vertes, R. P., Kocsis, B. Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neurociência. 81 (4), 893-926 (1997).
- Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices. Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).
- Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons. Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).
- Williams, J. H., Kauer, J. A. Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus. J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).
- Chapman, C. A., Lacaille, J. C. Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing. J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).
- Strata, F. Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation. Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).
- Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis. J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).
- Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands. Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).
- Gillies, M. J., et al. A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1. J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices. Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).
- Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum. J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).
- Amilhon, B., et al. Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency. Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).
- Huh, C. Y., et al. Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm. J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).
- Gu, N., et al. NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks. J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).
- Jackson, J., et al. Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits. Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).
- Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia. Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).
