هنا، نقدم بروتوكول لتسجيل الإيقاعي ثيتا شبكة العصبية وتذبذبات غاما من إعداد الحصين كله معزولة. نحن تصف الخطوات التجريبية من استخراج الحصين إلى تفاصيل الميدان، وحدوية وكل خلية التصحيح المشبك التسجيلات فضلا عن سرعة أوبتوجينيتيك من إيقاع ثيتا.
هذا البروتوكول يحدد إجراءات لإعداد وتسجيل من الحصين كله معزولة، من وت والفئران المعدلة وراثيا، جنبا إلى جنب مع التحسينات الأخيرة في المنهجيات والتطبيقات لدراسة التذبذبات ثيتا. يتم عرض توصيف بسيط لإعداد الحصين معزولة حيث يتم فحص العلاقة بين مؤشرات التذبذب الحصين ثيتا الداخلية جنبا إلى جنب مع نشاط الخلايا الهرمية، و غابايرجيك إنترنيورونس، من كورنو أمونيس -1 (CA1) والمناطق الفرعية (سوب) المناطق. عموما، وتبين لنا أن الحصين معزولة قادر على توليد التذبذبات ثيتا الجوهرية في المختبر ، وأن الإيقاع ولدت داخل الحصين يمكن التلاعب بها بدقة من قبل التحفيز أوبتوجينيتيك من البارفالبومين إيجابية (بف) إنترنيورونس. في المختبر معزولة إعداد الحصين يوفر فرصة فريدة لاستخدام في وقت واحد والتسجيلات داخل المشبك بين الخلايا من المشاهد بصريا تحديدها نيورونس لفهم أفضل للآليات الكامنة وراء جيل إيقاع ثيتا.
هيبوكامبال ثيتا التذبذبات (4-12 هرتز) هي من بين الأشكال الأكثر سائدة من النشاط الإيقاعي في الدماغ الثدييات ويعتقد أن تلعب أدوارا رئيسية في الوظائف المعرفية مثل معالجة المعلومات المكانية الزمانية وتشكيل ذكريات عرضية 1 ، 2 ، 3 . في حين أن العديد من الدراسات في الجسم الحي التي تسلط الضوء على العلاقة بين خلايا المكان ثيتا التضمين مع الملاحة المكانية والدراسات الآفة، وكذلك الأدلة السريرية، ودعم الرأي القائل بأن التذبذبات الحصين ثيتا تشارك في تشكيل الذاكرة 4 ، 5 ، 6 ، والآليات المرتبطة مع جيل من التذبذبات ثيتو الحصين لا تزال غير مفهومة تماما. في وقت مبكر من التحقيقات في الجسم الحي تشير إلى أن النشاط ثيتا تعتمد أساسا على مؤشرات التذبذب الخارجية، ولا سيما الإدخال الإيقاعيمن هياكل الدماغ وارد مثل الحاجز والقشرة المخية 7 ، 8 ، 9 ، 10 . تم أيضا افتراض دور العوامل الجوهرية – الربط الداخلي للشبكات العصبية قرن آمون مع خصائص الخلايا العصبية قرن آمون – استنادا إلى الملاحظات في المختبر 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 ، 18 . ومع ذلك، وبصرف النظر عن عدد قليل من الدراسات التاريخية 19 ، 20 ، 21 ، والصعوبات في تطوير النهج التي يمكن أن تكرر الأنشطة السكانية واقعية من الناحية الفسيولوجية في بسيطة في إعداد شريحة المختبرق، لفترة طويلة، تأخر الفحص التجريبي أكثر تفصيلا للقدرات الجوهرية للحصين والمناطق ذات الصلة لتوليد الذات التذبذبات ثيتا.
ومن الجوانب السلبية الهامة للمعيار في المختبر التجريبي شريحة رقيقة التجريبية هو أن التنظيم الخلوي 3D ومشبك من هياكل الدماغ وعادة ما يتعرض للخطر. وهذا يعني أنه لا يمكن دعم العديد من أشكال أنشطة الشبكات المتضافرة على أساس تجمعات الخلايا الموزعة مكانيا، والتي تتراوح بين المجموعات المحلية (نصف قطرها ≤1 ملم) لسكان الخلايا العصبية المنتشرة عبر واحد أو أكثر من مناطق المخ (> 1 مم). وبالنظر إلى هذه الاعتبارات، هناك حاجة إلى نوع مختلف من النهج لدراسة كيفية ظهور التذبذبات ثيتا في الحصين ونشرها إلى هياكل الانتاج القشرية والقشرية تحت القشرية ذات الصلة.
في السنوات الأخيرة، والتطور الأولي لل "كامل سيبتو الحصين" إعداد لدراسة إنتيرا ثنائي الاتجاهكتابات من اثنين من الهياكل 22 ، والتطور الذي أعقب ذلك من "الحصين معزولة" إعداد، كشفت أن تذبذبات ثيتا الجوهرية تحدث بشكل عفوي في الحصين تفتقر إلى المدخلات الإيقاعية الخارجية 23 . وتكمن قيمة هذه النهج في الرؤية الأولية التي مفادها أن الهيكل الوظيفي الكامل لهذه المناطق كان لا بد من الحفاظ عليه لكي يعمل كمولد إيقاع ثيتا في المختبر 22 .
في حين التسجيلات الكهربية من شرائح الحصين الحاد تشكل معيارا في تقنية المختبر ، والأساليب المعروضة هنا تختلف اختلافا كبيرا عن النهج الكلاسيكي. على عكس الاستعدادات شريحة رقيقة حيث طبقات خلية محددة مرئية على السطح ويمكن فحصها مباشرة، الاستعدادات الحصين سليم…
The authors have nothing to disclose.
وقد دعم هذا العمل المعاهد الكندية للبحوث الصحية والعلوم الطبيعية.
Reagents | |||
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
NaH2PO4 – sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
Scalpel Handle #4, 14cm | WPI | 500237 | brain extraction |
Filter forceps, flat jaws, straight (11cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
Lens paper (4X6 inch) | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
Olympus 2.5x objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
Olympus 40x water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
Custom-made light-emitting diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Animals | |||
PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |