Summary

Hippocampal 쎄타 밴드의 튜닝<em> 체외에서</em> : 격리 된 설치류 Septohippocampal Circuit에서 기록하는 방법론

Published: August 02, 2017
doi:

Summary

여기에서, 우리는 격리 된 전체 해마 제조물로부터 리듬 뉴런 네트워크 세타 및 감마 진동을 기록하기위한 프로토콜을 제시한다. 우리는 해마 추출에서 현장, 단일 및 전체 세포 패치 클램프 녹음뿐만 아니라 theta 리듬의 광 발생기 페이싱에 이르기까지의 실험 단계를 설명합니다.

Abstract

이 프로토콜은 세타 진동의 연구를위한 방법론 및 응용 프로그램의 최근 개선과 함께 고립 된 전체 해마, WT 및 유전자 변형 생쥐에서 준비하고 녹음 절차를 설명합니다. 고립 해마 준비의 간단한 특성 분석을 통해 내부 hippocampal theta 발진기와의 관계를 cornum ammonis-1 (CA1) 및 subiculum (SUB) 영역의 피라미드 세포 및 GABA 신경계 인터페론의 활성과 함께 검사합니다. 전반적으로, 우리는 고립 된 해마가 체외에서 본질적인 세타 진동 생성 할 수 있으며, 해마 내에 생성 된 리듬이 parvalbumin 양성 (PV) 신경 세포의 광학 유전 자극에 의해 정확하게 조작 될 수 있음을 보여줍니다. 시험관에서 분리 된 해마 제제는 시각적으로 확인 된 neu에서 동시에 현장 및 세포 내 패치 클램프 기록을 사용할 수있는 독특한 기회를 제공합니다theta 리듬 세대의 기본 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다.

Introduction

Hippocampal theta oscillations (4 – 12 Hz)는 포유 동물의 뇌에서 가장 두드러진 리듬 활동 중 하나이며, 시공간 정보의 처리 및 일란성 기억 1 , 2 , 3의 형성과 같은인지 기능에서 중요한 역할을한다고 여겨집니다. 공간 탐색 및 병변 연구와 함께 theta-modulated place-cell의 관계를 강조하는 몇 가지 생체 내 연구와 임상 증거는 hippocampal theta oscillations이 기억 형성 4 , 5 , 6에 관여한다는 견해를 뒷받침한다. 해마 생성의 세타 진동은 아직 완전히 이해되지 않았다. 초기 생체 내 조사는 세타 활성이 외인성 발진기, 특히 리듬 입력에 주로 의존한다고 제안했다중격과 entorhinal 피질 같은 구 심성 뇌 구조에서 7 , 8 , 9 , 10 . 내인성 요인 – 해마 신경 세포의 내부 연결성과 해마 뉴런의 성질 -은 시험관 내 관찰 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18에 근거하여 가정되었다. 그러나 몇 가지 획기적인 연구 19 , 20 , 21 을 제외하고 간단한 체외 조각 준비에서 생리적으로 현실적인 인구 활동을 복제 할 수있는 접근법을 개발하는 데 어려움이 있습니다오랫동안 해마와 그 주변의 본질적인 능력을 세타 진동을 스스로 발생시키는 데 더 상세한 실험적 검사를 지연시켰다.

체외의 얇은 슬라이스 실험 환경 에서 표준의 중요한 단점은 뇌 구조의 3D 세포 및 시냅스 조직이 일반적으로 손상된다는 것입니다. 즉, 공간적으로 분산 된 세포 어셈블리를 기반으로하는 여러 형태의 협동 네트워크 활동이 하나 이상의 뇌 영역 (> 1mm)에 걸쳐있는 국소 그룹 (반경 ≤1mm)에서 뉴런 인구에 이르기까지 지원 될 수 없습니다. 이러한 고려 사항을 감안할 때, 세타 진동이 해마에서 어떻게 나타나고 관련 피질 및 피질 하부 구조로 전파되는지 연구하는 데는 다른 유형의 접근법이 필요했습니다.

최근 몇 년 동안 양방향 intera를 검사하기위한 "완전한 septo-hippocampal"준비의 초기 개발두 구조물 (22) 및 「격리 해마 "제제 계속되는 진화 ctions는 고유 진동 세타 리듬 외부 입력 (23)이 결여 된 해마에서 자발적으로 발생하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 접근법의 값은 이들 영역의 전체 기능 구성이 체외 (22)에서의 세타 리듬 발전기로서 작동하기 위해 유지했다 초기 통찰력에 놓여있다.

Protocol

모든 절차는 McGill 대학 동물 관리위원회 및 동물 관리에 관한 캐나다위원회에서 승인 한 지침 및 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 급성 해마 in vitro 준비 참고 : 손상되지 않은 해마 준비를 분리하는 것은 (1) 솔루션 및 장비 준비, (2) 해마 해부 및 (3) 본질적인 세타 진동 생성에 필요한 빠른 관류 속도 시스템 설정. 이 프로토콜에서 해부에서 기록에 ?…

Representative Results

이 섹션 은 체외에서 마우스 격리 hippocampal 준비 에 세타 진동을 공부하여 얻을 수있는 결과의 예를 보여줍니다. 분리 된 해마를 추출하기위한 해부 절차는 그림 1에 설명되어 있습니다. 이 준비를 사용하여 내장 된 세타 진동은 여러 필드 전극을 배치하는 동안 검사 할 수 있으며 전반적인 활동을 기록하고 격리 된 해마의 여러 ​?…

Discussion

급성 hippocampal 조각에서 electrophysiological 녹음은 표준 체외 기술을 구성하는 동안, 여기에 제시된 방법은 고전적인 접근 방식과 크게 다릅니다. 특정 세포 층이 표면에서 볼 수 있고 직접 검사 할 수있는 얇은 슬라이스 준비와 달리 손상되지 않은 해마 준비물은 개별 층을 통과하면서 전극을 대상 뇌 영역으로 낮추는 생체 내 구성과 유사합니다. 해마의 무결성은 기능적 연결성 및 국?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 캐나다 보건 연구소 (Canadian Institute of Health Research and Natural Sciences)의 지원을 받았다.

Materials

Reagents
Sodium Chloride Sigma Aldrich S9625
Sucrose Sigma Aldrich S9378
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761
NaH2PO4 – sodium phosphate monobasic Sigma Aldrich S8282
Magnesium sulfate Sigma Aldrich M7506
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911
D-(+)-Glucose Sigma Aldrich G7528
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C5080
Sodium Ascorbate Sigma Aldrich A7631-25G
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Standard Dissecting Scissors Fisher Scientific 08-951-25 brain extraction
Scalpel Handle #4, 14cm WPI 500237 brain extraction
Filter forceps, flat jaws, straight (11cm) WPI 500456 brain extraction
Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 Ultident 02-90010-20 brain extraction
Fine Point Curved Dissecting Scissors Thermo Fisher Scientific 711999 brain extraction
Teflon (PTFE) -coated thin spatula VWR 82027-534 hippocampal preparation
Hayman Style Microspatula Fisher Scientific 21-401-25A hippocampal preparation
Lab spoon Fisher Scientific 14-375-20 hippocampal preparation
Borosilicate Glass Pasteur Pipets Fisher Scientific 13-678-20A hippocampal preparation
Droper Fisher Scientific hippocampal preparation
Razor blades Single edged VWR 55411-055 hippocampal preparation
Lens paper (4X6 inch) VWR 52846-001 hippocampal preparation
Glass petri dishes (100 x 20 mm) VWR 25354-080 hippocampal preparation
Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm n.a. n.a. hippocampal preparation
Single Inline Solution Heater Warner Instruments SH-27B perfusion system
Aquarium air stones for bubbling n.a. n.a. perfusion system
Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) Fisherbrand 14-171-129 perfusion system
Electric Skillet Black & Decker n.a. perfusion system
95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen)  Vitalaire SG466204A perfusion system
Glass bottles/flasks (4 x 1 L) n.a. n.a. perfusion system
Submerged recording Chamber custom design (FM) n.a. Commercial alternative may be used
Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) ) WPI 1B150F-4 electrophysiology
Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator Quest Scientific Q-Humbug electrophysiology
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier Molecular devices MULTICLAMP electrophysiology
Multiclamp 700B Commander Program Molecular devices MULTICLAMP electrophysiology
Digital/Analogue converter Molecular devices DDI440 electrophysiology
PCLAMP10 Molecular devices PCLAMP10 electrophysiology
Vibration isolation table  Newport n.a. electrophysiology
Micromanipulators (manually operated ) Siskiyou  MX130 electrophysiology (LFP)
Micromanipulators (automated) Siskiyou  MC1000e electrophysiology (patch)
Audio monitor  A-M Systems Model 3300 electrophysiology
Micropipette/Patch pipette puller Sutter P-97 electrophysiology
Custom-built upright fluorescence microscope Siskiyou n.a. Imaging
Analogue video camera COHU 4912-2000/0000 Imaging
Digital frame grabber with imaging software EPIX, Inc PIXCI-SV7 Imaging
Olympus 2.5x objective Olympus MPLFLN Imaging
Olympus 40x water immersion objective Olympus UIS2 LUMPLFLN Imaging
Custom-made light-emitting diode (LED) system  custom n.a. optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015)
Name Company Catalog Number Comments
Animals
PV::Cre (KI) mice Jackson Laboratory stock number 008069 Allow  Cre-directed gene expression in PV interneurons
Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) Jackson Laboratory stock number 007905 Express TdTomato following Cre-mediated recombination
Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP Jackson Laboratory stock
number 012569
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase
PVChY mice In house breeding n.a. Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP

Referências

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Citar este artigo
Manseau, F., Williams, S. Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit. J. Vis. Exp. (126), e55851, doi:10.3791/55851 (2017).

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