ضبط في الحصين ثيتا الفرقة<em> في المختبر</em>: منهجيات لتسجيل من القوارض معزولة سيبوهيبوكامبال الدائرة
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لتسجيل الإيقاعي ثيتا شبكة العصبية وتذبذبات غاما من إعداد الحصين كله معزولة. نحن تصف الخطوات التجريبية من استخراج الحصين إلى تفاصيل الميدان، وحدوية وكل خلية التصحيح المشبك التسجيلات فضلا عن سرعة أوبتوجينيتيك من إيقاع ثيتا.
Abstract
هذا البروتوكول يحدد إجراءات لإعداد وتسجيل من الحصين كله معزولة، من وت والفئران المعدلة وراثيا، جنبا إلى جنب مع التحسينات الأخيرة في المنهجيات والتطبيقات لدراسة التذبذبات ثيتا. يتم عرض توصيف بسيط لإعداد الحصين معزولة حيث يتم فحص العلاقة بين مؤشرات التذبذب الحصين ثيتا الداخلية جنبا إلى جنب مع نشاط الخلايا الهرمية، و غابايرجيك إنترنيورونس، من كورنو أمونيس -1 (CA1) والمناطق الفرعية (سوب) المناطق. عموما، وتبين لنا أن الحصين معزولة قادر على توليد التذبذبات ثيتا الجوهرية في المختبر ، وأن الإيقاع ولدت داخل الحصين يمكن التلاعب بها بدقة من قبل التحفيز أوبتوجينيتيك من البارفالبومين إيجابية (بف) إنترنيورونس. في المختبر معزولة إعداد الحصين يوفر فرصة فريدة لاستخدام في وقت واحد والتسجيلات داخل المشبك بين الخلايا من المشاهد بصريا تحديدها نيورونس لفهم أفضل للآليات الكامنة وراء جيل إيقاع ثيتا.
Introduction
هيبوكامبال ثيتا التذبذبات (4-12 هرتز) هي من بين الأشكال الأكثر سائدة من النشاط الإيقاعي في الدماغ الثدييات ويعتقد أن تلعب أدوارا رئيسية في الوظائف المعرفية مثل معالجة المعلومات المكانية الزمانية وتشكيل ذكريات عرضية 1 ، 2 ، 3 . في حين أن العديد من الدراسات في الجسم الحي التي تسلط الضوء على العلاقة بين خلايا المكان ثيتا التضمين مع الملاحة المكانية والدراسات الآفة، وكذلك الأدلة السريرية، ودعم الرأي القائل بأن التذبذبات الحصين ثيتا تشارك في تشكيل الذاكرة 4 ، 5 ، 6 ، والآليات المرتبطة مع جيل من التذبذبات ثيتو الحصين لا تزال غير مفهومة تماما. في وقت مبكر من التحقيقات في الجسم الحي تشير إلى أن النشاط ثيتا تعتمد أساسا على مؤشرات التذبذب الخارجية، ولا سيما الإدخال الإيقاعيمن هياكل الدماغ وارد مثل الحاجز والقشرة المخية 7 ، 8 ، 9 ، 10 . تم أيضا افتراض دور العوامل الجوهرية – الربط الداخلي للشبكات العصبية قرن آمون مع خصائص الخلايا العصبية قرن آمون – استنادا إلى الملاحظات في المختبر 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 ، 18 . ومع ذلك، وبصرف النظر عن عدد قليل من الدراسات التاريخية 19 ، 20 ، 21 ، والصعوبات في تطوير النهج التي يمكن أن تكرر الأنشطة السكانية واقعية من الناحية الفسيولوجية في بسيطة في إعداد شريحة المختبرق، لفترة طويلة، تأخر الفحص التجريبي أكثر تفصيلا للقدرات الجوهرية للحصين والمناطق ذات الصلة لتوليد الذات التذبذبات ثيتا.
ومن الجوانب السلبية الهامة للمعيار في المختبر التجريبي شريحة رقيقة التجريبية هو أن التنظيم الخلوي 3D ومشبك من هياكل الدماغ وعادة ما يتعرض للخطر. وهذا يعني أنه لا يمكن دعم العديد من أشكال أنشطة الشبكات المتضافرة على أساس تجمعات الخلايا الموزعة مكانيا، والتي تتراوح بين المجموعات المحلية (نصف قطرها ≤1 ملم) لسكان الخلايا العصبية المنتشرة عبر واحد أو أكثر من مناطق المخ (> 1 مم). وبالنظر إلى هذه الاعتبارات، هناك حاجة إلى نوع مختلف من النهج لدراسة كيفية ظهور التذبذبات ثيتا في الحصين ونشرها إلى هياكل الانتاج القشرية والقشرية تحت القشرية ذات الصلة.
في السنوات الأخيرة، والتطور الأولي لل "كامل سيبتو الحصين" إعداد لدراسة إنتيرا ثنائي الاتجاهكتابات من اثنين من الهياكل 22 ، والتطور الذي أعقب ذلك من "الحصين معزولة" إعداد، كشفت أن تذبذبات ثيتا الجوهرية تحدث بشكل عفوي في الحصين تفتقر إلى المدخلات الإيقاعية الخارجية 23 . وتكمن قيمة هذه النهج في الرؤية الأولية التي مفادها أن الهيكل الوظيفي الكامل لهذه المناطق كان لا بد من الحفاظ عليه لكي يعمل كمولد إيقاع ثيتا في المختبر 22 .
Protocol
Representative Results
Discussion
في حين التسجيلات الكهربية من شرائح الحصين الحاد تشكل معيارا في تقنية المختبر ، والأساليب المعروضة هنا تختلف اختلافا كبيرا عن النهج الكلاسيكي. على عكس الاستعدادات شريحة رقيقة حيث طبقات خلية محددة مرئية على السطح ويمكن فحصها مباشرة، الاستعدادات الحصين سليم…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المعاهد الكندية للبحوث الصحية والعلوم الطبيعية.
Materials
| Reagents | |||
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | |
| NaH2PO4 – sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S8282 | |
| Magnesium sulfate | Sigma Aldrich | M7506 | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C5080 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | A7631-25G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Standard Dissecting Scissors | Fisher Scientific | 08-951-25 | brain extraction |
| Scalpel Handle #4, 14cm | WPI | 500237 | brain extraction |
| Filter forceps, flat jaws, straight (11cm) | WPI | 500456 | brain extraction |
| Paragon Stainless Steel Scalpel Blades #20 | Ultident | 02-90010-20 | brain extraction |
| Fine Point Curved Dissecting Scissors | Thermo Fisher Scientific | 711999 | brain extraction |
| Teflon (PTFE) -coated thin spatula | VWR | 82027-534 | hippocampal preparation |
| Hayman Style Microspatula | Fisher Scientific | 21-401-25A | hippocampal preparation |
| Lab spoon | Fisher Scientific | 14-375-20 | hippocampal preparation |
| Borosilicate Glass Pasteur Pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | hippocampal preparation |
| Droper | Fisher Scientific | hippocampal preparation | |
| Razor blades Single edged | VWR | 55411-055 | hippocampal preparation |
| Lens paper (4X6 inch) | VWR | 52846-001 | hippocampal preparation |
| Glass petri dishes (100 x 20 mm) | VWR | 25354-080 | hippocampal preparation |
| Plastic tray for ice; size 30 x 20 x 5 cm | n.a. | n.a. | hippocampal preparation |
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | SH-27B | perfusion system |
| Aquarium air stones for bubbling | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Tygon E-3603 tubing (ID 1/16 OD 1/8) | Fisherbrand | 14-171-129 | perfusion system |
| Electric Skillet | Black & Decker | n.a. | perfusion system |
| 95% O2/5% CO2 gas mixture (carbogen) | Vitalaire | SG466204A | perfusion system |
| Glass bottles/flasks (4 x 1 L) | n.a. | n.a. | perfusion system |
| Submerged recording Chamber | custom design (FM) | n.a. | Commercial alternative may be used |
| Glass pipettes (1.5 / 0.84 OD/ID (mm) ) | WPI | 1B150F-4 | electrophysiology |
| Hum Bug 50/60 Hz Noise Eliminator | Quest Scientific | Q-Humbug | electrophysiology |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Multiclamp 700B Commander Program | Molecular devices | MULTICLAMP | electrophysiology |
| Digital/Analogue converter | Molecular devices | DDI440 | electrophysiology |
| PCLAMP10 | Molecular devices | PCLAMP10 | electrophysiology |
| Vibration isolation table | Newport | n.a. | electrophysiology |
| Micromanipulators (manually operated ) | Siskiyou | MX130 | electrophysiology (LFP) |
| Micromanipulators (automated) | Siskiyou | MC1000e | electrophysiology (patch) |
| Audio monitor | A-M Systems | Model 3300 | electrophysiology |
| Micropipette/Patch pipette puller | Sutter | P-97 | electrophysiology |
| Custom-built upright fluorescence microscope | Siskiyou | n.a. | Imaging |
| Analogue video camera | COHU | 4912-2000/0000 | Imaging |
| Digital frame grabber with imaging software | EPIX, Inc | PIXCI-SV7 | Imaging |
| Olympus 2.5x objective | Olympus | MPLFLN | Imaging |
| Olympus 40x water immersion objective | Olympus | UIS2 LUMPLFLN | Imaging |
| Custom-made light-emitting diode (LED) system | custom | n.a. | optogenetic stimulation (Amhilon et al., 2015) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| PV::Cre (KI) mice | Jackson Laboratory | stock number 008069 | Allow Cre-directed gene expression in PV interneurons |
| Constitutive-conditional Ai9 mice (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI)) | Jackson Laboratory | stock number 007905 | Express TdTomato following Cre-mediated recombination |
| Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP | Jackson Laboratory | stock number 012569 |
Express the improved channelrhodopsin-2/EYFP fusion protein following exposure to Cre recombinase |
| PVChY mice | In house breeding | n.a. | Offspring obtained from cross-breeding the PV-Cre line with Ai32 mice (R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP |
Referências
- Buzsaki, G. Theta rhythm of navigation: link between path integration and landmark navigation, episodic and semantic memory. Hippocampus. 15 (7), 827-840 (2005).
- Sanders, H., Renno-Costa, C., Idiart, M., Lisman, J. Grid Cells and Place Cells: An Integrated View of their Navigational and Memory Function. Trends Neurosci. 38 (12), 763-775 (2015).
- O’Keefe, J., Recce, M. L. Phase relationship between hippocampal place units and the EEG theta rhythm. Hippocampus. 3 (3), 317-330 (1993).
- Winson, J. Loss of hippocampal theta rhythm results in spatial memory deficit in the rat. Science. 201 (4351), 160-163 (1978).
- M’Harzi, M., Jarrard, L. E. Strategy selection in a task with spatial and nonspatial components: effects of fimbria-fornix lesions in rats. Behav Neural Biol. 58 (3), 171-179 (1992).
- Osipova, D., et al. Theta and gamma oscillations predict encoding and retrieval of declarative memory. J Neurosci. 26 (28), 7523-7531 (2006).
- Stumpf, C., Petsche, H., Gogolak, G. The significance of the rabbit’s septum as a relay station between the midbrain and the hippocampus. II. The differential influence of drugs upon both the septal cell firing pattern and the hippocampus theta activity. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 14, 212-219 (1962).
- Mitchell, S. J., Ranck, J. B. Generation of theta rhythm in medial entorhinal cortex of freely moving rats. Brain Res. 189 (1), 49-66 (1980).
- Alonso, A., Garcia-Austt, E. Neuronal sources of theta rhythm in the entorhinal cortex of the rat. I. Laminar distribution of theta field potentials. Exp Brain Res. 67 (3), 493-501 (1987).
- Vertes, R. P., Kocsis, B. Brainstem-diencephalo-septohippocampal systems controlling the theta rhythm of the hippocampus. Neurociência. 81 (4), 893-926 (1997).
- Bland, B. H., Colom, L. V., Konopacki, J., Roth, S. H. Intracellular records of carbachol-induced theta rhythm in hippocampal slices. Brain Res. 447 (2), 364-368 (1988).
- Cobb, S. R., Buhl, E. H., Halasy, K., Paulsen, O., Somogyi, P. Synchronization of neuronal activity in hippocampus by individual GABAergic interneurons. Nature. 378 (6552), 75-78 (1995).
- Williams, J. H., Kauer, J. A. Properties of carbachol-induced oscillatory activity in rat hippocampus. J Neurophysiol. 78 (5), 2631-2640 (1997).
- Chapman, C. A., Lacaille, J. C. Cholinergic induction of theta-frequency oscillations in hippocampal inhibitory interneurons and pacing of pyramidal cell firing. J Neurosci. 19 (19), 8637-8645 (1999).
- Strata, F. Intrinsic oscillations in CA3 hippocampal pyramids: physiological relevance to theta rhythm generation. Hippocampus. 8 (6), 666-679 (1998).
- Kocsis, B., Bragin, A., Buzsaki, G. Interdependence of multiple theta generators in the hippocampus: a partial coherence analysis. J Neurosci. 19 (14), 6200-6212 (1999).
- Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Cholinergic induction of oscillations in the hippocampal slice in the slow (0.5-2 Hz), theta (5-12 Hz), and gamma (35-70 Hz) bands. Hippocampus. 10 (2), 187-197 (2000).
- Gillies, M. J., et al. A model of atropine-resistant theta oscillations in rat hippocampal area CA1. J Physiol. 543 (Pt 3), 779-793 (2002).
- Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13295-13300 (2005).
- Konopacki, J., Eckersdorf, B., Kowalczyk, T., Golebiewski, H. Firing cell repertoire during carbachol-induced theta rhythm in rat hippocampal formation slices. Eur J Neurosci. 23 (7), 1811-1818 (2006).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Manseau, F., Goutagny, R., Danik, M., Williams, S. The hippocamposeptal pathway generates rhythmic firing of GABAergic neurons in the medial septum and diagonal bands: an investigation using a complete septohippocampal preparation in vitro. J Neurosci. 28 (15), 4096-4107 (2008).
- Goutagny, R., Jackson, J., Williams, S. Self-generated theta oscillations in the hippocampus. Nat Neurosci. 12 (12), 1491-1493 (2009).
- Jackson, J., Goutagny, R., Williams, S. Fast and slow gamma rhythms are intrinsically and independently generated in the subiculum. J Neurosci. 31 (34), 12104-12117 (2011).
- Amilhon, B., et al. Parvalbumin Interneurons of Hippocampus Tune Population Activity at Theta Frequency. Neuron. 86 (5), 1277-1289 (2015).
- Huh, C. Y., et al. Excitatory Inputs Determine Phase-Locking Strength and Spike-Timing of CA1 Stratum Oriens/Alveus Parvalbumin and Somatostatin Interneurons during Intrinsically Generated Hippocampal Theta Rhythm. J Neurosci. 36 (25), 6605-6622 (2016).
- Gu, N., et al. NMDA-dependent phase synchronization between septal and temporal CA3 hippocampal networks. J Neurosci. 33 (19), 8276-8287 (2013).
- Jackson, J., et al. Reversal of theta rhythm flow through intact hippocampal circuits. Nat Neurosci. 17 (10), 1362-1370 (2014).
- Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. GABA neurons and the mechanisms of network oscillations: implications for understanding cortical dysfunction in schizophrenia. Schizophr Bull. 34 (5), 944-961 (2008).
