Summary

体外初期エンドソームの F-アクチンの重合

Published: August 28, 2017
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Summary

初期エンドソーム機能 F アクチンの重合によって決まります。ここで、この複雑な一連の反応の生化学的・遺伝的影響を受けやすいレンダリング核生成と、試験管の初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイを説明します。操作。

Abstract

多機能初期エンドソーム、特に貨物蛋白質を並べ替えると膜変形、エンドソームの膜の上に核形成した短い F アクチンのパッチに依存します。この複雑な一連の反応の遺伝学的および生化学的影響を受けやすいレンダリング核生成と、試験管の初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイを設けています。操作。エンドソーム分数は初期エンドソーム タンパク質 RAB5 GFP を発現する細胞からのサッカロースの勾配の浮上によって準備されます。細胞質画分は、細胞の別のバッチから用意しています。エンドソームと細胞質画分格納できます液体窒素で凍結に必要な場合。アッセイのエンドソームと細胞質画分を混合、および混合物は、適切な条件 (例えば、イオン強度、環境を削減) の 37 ° C で培養しました。希望の時間に反応混合物を固定すると、および F-アクチン ファロイジンで明らかにされます。アクチン核形成と重合は、蛍光顕微鏡で分析しています。ここで、アクチン核形成膜、またはそれ以降の伸び、分岐、または F アクチン繊維の架橋のどちらかに関与している因子の役割を調査するこのアッセイを使用ことができることを報告します。

Introduction

高等真核生物の細胞のタンパク質や脂質は並べ替えが発生する初期エンドソームを内面化します。いくつかのタンパク質や脂質は、住宅がする運命にあるは初期エンドソームの管状地域に組み込むし、トランスゴルジ ネットワーク (TGN)12細胞膜に輸送。対照的に、他のタンパク質や脂質は、多胞性の外観を示す初期エンドソームの領域に選択的にパッケージ化されます。これらの領域を展開し、初期エンドソーム膜から剥離時に無料エンドソーム キャリア小胞または多胞体 (ECV/MVBs) に最終的に成熟したから責任がある後期エンドソーム1,に向かって貨物輸送2

アクチンは、エンドソーム並べ替え容量とエンドソームの形成と関連付けられる膜改造プロセスで重要な役割を果たしています。タンパク質のリサイクルの経路に沿って、TGN の細胞膜には、レトロマー複合体と関連付けられているタンパク質に依存します。この仕分けの機械リサイクル尿細管を介しての相互作用レトロマー複合体、ハチと傷跡相同 (洗浄) 複雑で分岐したアクチン3,4,5 の形成を結合するようであります。.対照的に、分子分解運命、特にシグナル受容体を活性化、エンドソーム選別輸送 (ESCRT)2,6、複合体によって管腔内小胞 (ILVs) に分類されます。 7。アクチン ESCRT 依存ソート処理の可能な役割は知られていない、F アクチンは ECV/MVBs の生合成におけるや早期エンドソームを超えて輸送に重要な役割を果たしています。特に、アネキシン A2 初期エンドソームと spire1 と共にコレステロール濃縮の領域にバインド、nucleates F アクチンの重合がわかった。エンドソームに観察される分岐アクチン ネットワークの形成がアクチン関連タンパク質 (ARP) 2/3 の分岐のアクティビティを必要とする複雑でと同様、ERM タンパク質モエシン、アクチン結合タンパク質 cortactin8,9

ここでは、核生成と試験管内初期エンドソーム膜に F-アクチンの重合を再構成培養顕微鏡ベースのアッセイをについて説明します。この試金は、A2 を F-アクチン核形成におけるアネキシンとモエシンとエンドソーム アクチン ネットワーク8,9の形成の役割を調べるため以前使用されています。この体外プロトコルで複雑な一連のエンドソームでアクチンの重合時に発生する反応なるアクチン核形成、線形を含むプロセスの一連のステップの生化学的および分子の分析に従う義務があります。重合、分岐、および架橋。

Protocol

1 ですソリューションおよび準備 注: すべてのバッファーおよび解決は、ダブル蒸留 (dd) H 2 o. で準備する必要が。糖度計を使用してすべてのスクロース溶液の最終濃度を決定する必要がありますショ糖の水和状態によって異なりますので、. 準備リン酸緩衝生理食塩水 (PBS-) の二価陽イオンなし: 137 mM よる、2.7 mM KCl、1.5 mM KH 2 PO 4、および…

Representative Results

F-アクチンのパッチを初期エンドソーム膜形成についての洞察を得るためには、図 2に示すプロトコルを追った簡単に言えば、細胞が GFP RAB5 を導入させたし、し、初期エンドソームは細胞レベル下の分別により作製しました。これらの精製された初期エンドソーム自体だけでなく、他の反応に関与の可能性の要因は、アクチンを提供するために?…

Discussion

アクチンは、エンドソーム膜ダイナミクス4,14の重要な役割を果たしています。我々 はアクチン核形成と重合では、初期エンドソーム小 F アクチン パッチやネットワーク形成を報告しました。これら F アクチン ネットワークがを超えて分解経路に沿って早期エンドソーム膜輸送のため絶対に必要です。この核と重合プロセスのすべてのステップに?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

スイス国立科学財団からの支援を得てください。スイスの Sinergia プログラム;ポーランド語-スイスのリサーチ ・ プログラム (PSPB-094/2010)化学生物学の国立がんスイス SystemsX.ch イニシアティブから LipidX (j. g.) にスイスの全米科学財団によって評価されます。O. m. は、エンボ長期フェローシップ (ALTF-516-2012) によって支えられました。

Materials

NaCl Sigma-Aldrich 71380
KCl Acros Organics 196770010
KH2PO4 AppliChem A1042
Na2HPO4 Acros Organics 424370025
Hepes AppliChem A3724
Magnesiun acetate tetrahydrate Fluka 63047
Dithiothreitol (DTT) AppliChem A2948
Imidazole Sigma-Aldrich 10125
NaOH Fluka 71690
Sucrose Merck Millipore 107687
Leupeptin Roche 11017101001
Pepstatin Roche 10253286001
Aprotinin Roche 10236624001
Paraformaldehide Polysciences. Inc 380
Alexa Fluor 555 phalloidin Molecular Probes A34055
Actin rhodamine Cytoskeleton. Inc APHR-A
Mowiol 4-88 Sigma-Aldrich 81381 poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 
DABCO Sigma-Aldrich D-2522
Tris-HCl AppliChem A1086
β-casein Sigma-Aldrich C6905
Filter 0.22um Millex  SL6V033RS
Round 10cm dishes for cell culture Thermo Fisher Scientific 150350
Plastic Pasteur pipette Assistent 569/3 40569003
15-ml polypropylen tube  TPP 91015
Hypodermic Needle 22G Black 30mm  BD Microlance 300900
Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle BD Plastipak 300013
Micro glass slides  Assistent 2406
18X18-mm glass coverslip Assistent 1000/1818
SW60 centrifuge tube Beckman coulter 344062
TLS-55 centrifuge tube Beckman coulter 343778
200-μl yellow tip Starlab S1111-0706
1000-μl Blue Graduated Tip Starlab S1111-6801
1.5-ml test tube Axygen MCT-175-C 311-04-051
18-mm diameter round coverslip  Assistent 1001/18
35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm)  In vitro Scientific D35-20-1.5-N
Refractometer Carl Zeiss 79729
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-32G
Sorvall WX80 Ultracentrifuge Thermo Fisher Scientific 46900
Tabletop ultracentrifuge Beckman coulter TL-100
SW60 rotor Beckman coulter 335649
TLS-55 rotor Beckman coulter 346936
Confocal microscopy Carl Zeiss LSM-780
Fugene HD transfection reagent Promega E2311
Protein assay reagent A Bio-Rad 500-0113
Protein assay reagent B Bio-Rad 500-0114
Protein assay reagent S Bio-Rad 500-0115
Cell scraper Homemade Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps
Refractometer Carl Zeiss
Minimum Essential Medium Eagle (MEM) Sigma-Aldrich M0643
FCS Thermo Fisher Scientific 10270-106
MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Thermo Fisher Scientific 11140-035
L-Glutamine  Thermo Fisher Scientific 25030-024
Penicillin-Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122
pH Meter 691 Metrohm
ImageJ software NIH, Bethesda MD

Referências

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Citar este artigo
Muriel, O., Scott, C. C., Larios, J., Mercier, V., Gruenberg, J. In Vitro Polymerization of F-actin on Early Endosomes. J. Vis. Exp. (126), e55829, doi:10.3791/55829 (2017).

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