Analyse des interactions protéine-protéine et co-localisation entre les composants de Gap, Tight et Adherens Junctions dans les glandes mammaires murines
Summary
Les jonctions inter-cellulaires sont indispensables pour les fonctions et le développement de la glande mammaire. Ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour l'étude des interactions protéines-protéines (IPP) et la co-localisation à l'aide de glandes mammaires murines. Ces techniques permettent d'étudier la dynamique de l'association physique entre les jonctions intercellulaires à différents stades de développement.
Abstract
Les interactions cellule-cellule jouent un rôle central dans la préservation de l'intégrité tissulaire et la barrière entre les différents compartiments de la glande mammaire. Ces interactions sont fournies par des protéines de jonction qui forment des liens entre des cellules adjacentes. La délocalisation des protéines jonctionnelles et la réduction des associations physiques avec leurs partenaires de liaison peuvent entraîner une perte de fonction et, par conséquent, une dysfonction organique. Ainsi, l'identification de la localisation des protéines et des interactions protéines-protéines (IPP) dans les tissus normaux et liés à la maladie est essentielle pour trouver de nouvelles preuves et des mécanismes conduisant à la progression des maladies ou des altérations du statut de développement. Ce manuscrit présente une méthode en deux étapes pour évaluer les IPP dans les glandes mammaires murines. Dans la section de protocole 1, on décrit un procédé pour effectuer une co-immunofluorescence (co-IF) en utilisant des anticorps dirigés contre les protéines d'intérêt, suivi d'anticorps secondaires marqués avec des fluorochromes. Bien que co-IF tousPour la démonstration de la proximité des protéines, il permet d'étudier leurs interactions physiques. Par conséquent, un protocole détaillé pour la co-immunoprécipitation (co-IP) est fourni dans la section de protocole 2. Cette méthode est utilisée pour déterminer les interactions physiques entre les protéines, sans confirmer si ces interactions sont directes ou indirectes. Au cours des dernières années, les techniques de co-IF et co-IP ont démontré que certaines composantes des jonctions intercellulaires co-localisent et interagissent ensemble, créant des liens de jonction dépendant de la scène qui varient au cours du développement de la glande mammaire.
Introduction
La croissance et le développement des glande mammaire surviennent principalement après la naissance. Cet organe se remodèle constamment tout au long de la vie reproductive d'un mammifère 1 . L'épithélium de la glande mammaire adulte est constitué d'une couche interne de cellules épithéliales luminescentes et d'une couche externe de cellules basales, principalement composée de cellules myo-épithéliales, entourée d'une membrane basale 2 . Pour une bonne évaluation de la structure et du développement des glandes mammaires, le lecteur peut se référer à Sternlicht 1 . Les interactions cellule-cellule via l'intervalle (GJ), les contraintes (TJ) et les adhérences (AJ) sont nécessaires pour le développement normal et le fonctionnement de la glande 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Les principaux composants de ces jonctions dans la glande mammaire murine sont Cx26, Cx30, Cx32 et Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 et -7 etZO-1 (TJ); Et E-cadhérine, P-cadhérine et β-caténine (AJ) 7 , 8 . Les niveaux d'expression de ces différentes protéines de jonction varient d'une manière dépendant de la phase pendant le développement de la glande mammaire, suggérant des besoins différentiels d'interaction cellule-cellule 9 . GJ, TJ et AJ sont liés structurellement et fonctionnellement et attachent d'autres protéines structurales ou réglementaires aux sites voisins des cellules adjacentes, créant ainsi un lien de jonction 10 . La composition du lien de jonction peut influer sur le pontage avec le cytosquelette sous-jacent, ainsi que sur la perméabilité et la stabilité du nexus et peut influencer la fonction de la glande 8 , 9 , 10 , 11 . Les composants des jonctions intercellulaires résidant dans les nexus de jonction ou interagissent les uns avec les autres à la différenceDes stades de développement importants du développement de la glande mammaire ont été analysés récemment en utilisant une co-immunofluorescence (co-IF) et une co-immunoprécipitation (co-IP) 9 . Bien que d'autres techniques permettent d'évaluer l'association fonctionnelle entre les protéines, ces méthodes ne sont pas présentées dans ce manuscrit.
Comme les protéines fonctionnent simplement pour fonctionner, l'étude des interactions protéine-protéine (IPP), telles que les transductions de signaux et les cascades biochimiques, est essentielle pour de nombreux chercheurs et peut fournir des informations importantes sur la fonction des protéines. La co-IF et l'analyse microscopique permettent d'évaluer quelques protéines qui partagent le même espace sous-cellulaire. Cependant, le nombre de cibles est limité par les anticorps, qui doivent être élevés chez différents animaux et par l'accès à un microscope confocal équipé de différents lasers à longueurs d'onde et un détecteur spectral pour le multiplexage. Co-IP confirme ou révèle des interactions physiques à haute affinité entreDeux protéines ou plus résidant dans un complexe protéique. Malgré le développement de nouvelles techniques, telles que le transfert d'énergie de résonance de fluorescence (FRET) 12 et le test de ligature de proximité (PLA) 13 , qui peuvent simultanément détecter la localisation et les interactions des protéines, la co-IP reste une technique appropriée et abordable pour étudier les interactions entre Protéines endogènes.
La méthode étape par étape décrite dans ce manuscrit facilitera l'étude de la localisation des protéines et des IPP et soulignera les pièges à éviter lors de l'étude des PPI endogènes dans les glandes mammaires. La méthodologie commence par la présentation des différentes procédures de conservation des tissus requis pour chaque technique. La partie 1 présente comment étudier la co-localisation des protéines en trois étapes: i) la section des glandes mammaires, ii) l'étiquetage double ou triple de différentes protéines utilisant la technique co-IF, et iii) l'imagerie deLocalisation des protéines. La partie 2 montre comment précipiter une protéine endogène et identifier ses protéines qui interagissent en trois étapes: i) préparation de lysat, ii) immunoprécipitation indirecte de protéines, et iii) identification de partenaire de liaison par SDS-PAGE et Western Blot. Chaque étape de ce protocole est optimisée pour les tissus de glandes mammaires des rongeurs et génère des résultats de haute qualité, spécifiques et reproductibles. Ce protocole peut également être utilisé comme point de départ pour les études de PPI dans d'autres tissus ou lignées cellulaires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les interactions cellule-cellule par des jonctions sont nécessaires pour la bonne fonction et le développement de nombreux organes, comme la glande mammaire. Des études ont montré que les protéines de jonction peuvent réguler la fonction et la stabilité l'une de l'autre et activer la transduction du signal en s'attachant mutuellement à la membrane 10 de la cellule. Les protocoles présentés dans le manuscrit actuel ont fourni des résultats intéressants sur l'expression,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La PI est financée par une subvention du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (NSERC n ° 418233-2012); Un Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS), une bourse de carrière de la Fondation du cancer du sein du Québec et une subvention Leader Founds de la subvention de la Fondation canadienne pour l'innovation. ED a reçu une bourse de la Fondation universitaire Armand-Frappier.
Materials
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10X (stock) | 1) Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.4 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
||
| TBS 10X (stock) | 1) Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.5 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1-Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | Mentioned in Column D | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2-Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0 | 1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | Mentioned in coulmn D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
Referências
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