ניתוח Supercomplexes של Mitochondrial אלקטרונים שרשרת התחבורה עם אלקטרופורזה הילידים, ב-מבחני ג'ל, ו Electroelution

אנרגיה מיטוכונדריאלית בצורה של ATP אינה חיונית רק להישרדות התא, אלא גם להסדרת מוות התא. הדור של ATP על ידי זירזון חמצוני דורש שרשרת תובלה אלקטרונית תפקודית (ETC, Cx-I ל- IV) ו synthase ATP המיטוכונדריה (Cx-V). מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי אלה קומפלקסים חלבונים גדולים מאורגנים supercomplexes, נקרא respirasomes ו synthasomes ^{1 , 2} . זה מאתגר לנתח את הרכבה, דינמיקה, ויסות הפעילות של אלה קומפלקסים מסיבי supercomplexes. בעוד מדידות צריכת חמצן שנלקחו עם אלקטרודה חמצן מבחני אנזים שנערכו באמצעות ספקטרופוטומטר יכול לתת מידע בעל ערך על פעילות מורכבים ETC, מבחני אלה לא יכולים לספק מידע לגבי נוכחות, גודל, הרכב הרכב משנה של קומפלקס חלבון או supercomplexes המעורבים. עם זאת, פיתוח של יליד כחול ברור (BN ו- CN, בהתאמה) עמוד ³ יצרה כלי רב עוצמה לחשוף מידע חשוב על הרכב מורכבים הרכבה / פירוק ועל הרגולציה הדינמית של הארגון supramolecular של אלה מתחמי הנשימה חיוני בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים ⁴ .

הרכבה של קומפלקסים אלה לתוך supercomplexes בסדר גבוה יותר נראה להסדיר מבנה המיטוכונדריה ותפקוד ⁵ . לדוגמה, הרכבה respirasome מגביר את היעילות של העברת אלקטרונים ואת הדור של כוח המניע פרוטון על פני קרום פנימי המיטוכונדריה ⁵ . בנוסף, הרכבה של synthasomes לא רק מגביר את היעילות של ייצור ה- ATP והעברת שווי אנרגיה לתוך הציטופלסמה ² , אבל זה גם עובש את הממברנה הפנימית המיטוכונדריאלי לתוך cristae ⁶ צינורי ^,/ Sup> ⁷ . מחקרים של הרכבה supercomplex במהלך התפתחות הלב בעוברים עכבר עולה כי הדור של Cx-I המכילים supercomplexes בלב מתחיל בערך ביום עובריים 13.5 ⁸ . אחרים הראו כי כמות supercomplexes המכיל Cx-I פוחתת בלב עקב הזדקנות או איסכמיה / reperfusion פציעות ^{9 , 10} או יכול לשחק תפקיד בהתקדמות של מחלות ניווניות ¹¹ .

פרוטוקול זה מתאר שיטות ג 'ל הילידים PAGE שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את הרכבה ופעילות של מתחמי ETC ו supercomplexes. המשקל המולקולרי המשוער של supercomplexes המיטוכונדריה ניתן להעריך על ידי הפרדת מתחמי חלבון CN או BN polyacrylamide ג'לים. CN PAGE גם מאפשר הדמיה של הפעילות האנזימטית של כל מתחמי המיטוכונדריה ישירות הג'ל (ב-מבחני ג'ל;IGA) ¹² . עבודה זו מדגימה את הפעילות של respirasomes על ידי הדגשת היכולת של Cx-I לחמצן NADH דרך IGA ואת נוכחות של synthasomes בשל פעילות ATP- hydrolyzing של CX-V על ידי IGA. קומפלקסים מרובים supercomplexes המכילים Cx-I ו CX-V יכול גם להיות הוכח על ידי העברת חלבונים על גבי קרומי ניטרוצלולוזה וביצוע immunoblotting. היתרון של גישה זו היא כי BN או CN PAGE בדרך כלל מפריד מתחמי חלבון על פי גודל פיזיולוגי שלהם הרכב; ההעברה לקרום משמרת תבנית זו של להקות. ניתוח מתחמי חלבון בדף BN או CN יכול להיעשות גם באמצעות 2D-PAGE (ראה Fiala et al ¹³ להפגנה) או על ידי צנטריפוגה צפיפות סוכרוז ^{14 , 15} . כדי לנתח עוד להקה ספציפית, זה יכול להיות נכרת מן דף BN, ואת החלבונים ממכלול חלבון זה יכול להיות purifieד על ידי electroeluting אותם בתנאים הילידים. Electroution יליד יכול להתבצע בתוך כמה שעות, אשר יכול לעשות הבדל משמעותי דיפוזיה פסיבית (כמו בשימוש הפניה 16) של חלבונים מן ג'ל לתוך חיץ הסובבים.

לסיכום, שיטות אלה מתארות מספר גישות המאפשרות את אפיון נוסף של supercomplexes משקל מולקולרית גבוהה ממברנות המיטוכונדריה.