Minimal invaziv kas katıştırma (iskelet kas dokusu içine implante zaman donör-Hücre-aracılı myogenesis kolaylaştıran myogenic hücrelerin içerir kanıtlara dayalı MIME), dediğimiz yeni bir deneysel teknik tarif bir ana bilgisayar kas.
İskelet kas doku yerleşik, kas lif üreten (myogenic) uydu doğru koşullar altında yeni kas lifleri oluşturan hücreleri (SCs), nedeniyle yeniden üretim kapasitesi sahiptir. SCs kas dokusundan hasat ve vitrokültürlü olsa da, elde edilen myoblast hücreler ana kas nakledilen zaman myogenesis teşvik çok etkili değildir. Cerrahi olarak ana kas teşhir ve segmentleri donör kas dokusu veya izole kas lifleri ile onların SCs ana kas, üzerine aşılama daha iyi myogenesis myoblast nakli için karşılaştırıldığında teşvik etmektedir. Minimal invaziv kas katıştırma (MIME) dediğimiz bir roman tekniği geliştirdik. MIME ana kas cerrahi bir iğne geçirerek, donör kas doku iğne parça ile bir parça çizim ve SCs ana kas için bir kaynak olarak hareket edebilir böylece ana kas gömülü donör doku bırakarak içerir. Burada biz ayrıntılı adımları yeşil flüoresan protein (GFP) ifade eder bir immünyetmezligi fare modelinde MIME gerçekleştirmede dahil onun hücrelerin tümünü tanımlamak. Ana bilgisayar Mouse immün yetmezlik bağışıklık donör Doku reddi riskini azaltır ve ana kas lifleri (GFP +) ve kas lifleri (GFP-) donör-hücre kaynaklı kolay tanımlanması GFP ifade sağlar. Bizim pilot verileri MIME ekstansiyon digitorum longus (EDL) kas bir donör fareden tibialis anterior (TA) kasına bir ana bilgisayar fare implant için kullanılabilir göstermektedir. Bizim veri aynı zamanda bir myotoxin (Baryum klorür, BaCl2) MIME sonra ana kas içine enjekte edildiğinde, orada olduğunu donör-hücre kaynaklı myogenesis yaklaşık % 5, % 26, % 26 ve % 43 tek konak TA liflerinin ana kas kanıtı göstermektedir hiçbir ana bilgisayar katkı, en az ana bilgisayar katkı, orta ana bilgisayar katkı ve maksimal ana bilgisayar katkı, sırasıyla gösteren kas.
Sağlıklı kas iskelet, sonrası Mitotik olsa bile, doku yerleşik myogenic hücreleri uydu hücreleri (SCs)1,2olarak bilinen varlığı nedeniyle mükemmel rejeneratif kapasite sahip; ve gözden geçirilen3,4. Ancak, kas dystrophies, travma ya da hızlandırılmış yaşlanma tarafından neden olduğu patolojik şartlar altında kas rejenerasyon kas arıza ile tutmak değil ve bu nedenle5aşamalı kas lif kaybı oluşur. SCs kas yalıtmak ve kültür myoblasts (ve daha sonra myotubes) çok sayıda oluşturmak için bunları genişletmek için etkili yöntemler geliştirilmiştir rağmen ana kas kas liflerinin fizyolojik ilgili numara oluşturmak için girişimleri var Sadece çok az başarı6vermiştir. Myoblasts tek başına ana bilgisayar doku enjekte edildiğinde olarak birçok hücre tipleri ile hücrelerin çoğu7,8engraft değil. Nöromüsküler elektriksel stimülasyon (NMES) donör-hücre kaynaklı myogenesis insan myoblasts8ile enjekte rejenerasyon eksikliği ana bilgisayar fare kas kolaylaştırır göstermiştir. Diğerleri cerrahi olarak aşılama biyopsi kas veya tek kas lifleri ile ekli SCs, orta myogenesis bile NMES tüm kas lifleri ile SCs Reproduction yerleştirilmesi daha daha avantajlı olabilir düşündüren, olmadan kolaylaştırmak göstermiştir myogenic hücreleri tek başına9,10. Donör veya ana bilgisayar kasına aşılı mühendislik kas dokusu hücreleri yalnız nakli daha iyi sonuçlar üretir beri dokusu veya doku benzeri yapılar çok önemli ipuçları için donör hücreli engraftment sağlayabilir mümkündür; çeşitli hücre türleri10,11,12içeren hücre tedavisi çalışmalarda giderek belirgin hale geliyor bir kavram.
Son veriler SCs insanlardan elde daha fazla 2 hafta post mortem myotubes kültür13‘ te oluşturmak olduğunu göstermektedir. Bu nedenle kas doku hasat öldükten sonra implantasyon içine bir yaşam ana kas lif kaybı tersine çevirir olmadığını değerlendirmek istiyoruz. Donör-hücre kaynaklı myogenesis tanıtmak için bir yaşam ana iskelet kas dokusuna donör kas dokusu implant MIME adında bir roman teknik geliştirdik. MIME ile cerrahi iğne iğne parça oluşturmak için ana bilgisayar kas ile ilgilidir; donör kas doku iğne parça ile küçük bir parça çizme; donör doku bırakarak ana kas gömülü; ve doku yapıştırıcı ile iğne delikleri yaklaşıyor. Ötenazi farelerde tekniği uygulamak okudu sonra diğer deneylerde şimdi MIME immünyetmezligi canlı farelerde yapılan ve ubiquitously yeşil flüoresan protein (GFP) hızlı ve doğumdan 3 ve 14 gün sonra takip sonrası Mim. 3 gün sonrası MIME donör fare (GFP-) Edi kas (GFP +) TA kas, ana kas gömülü kalır ana bilgisayar fare implante onaylayın. 14 gün sonrası MIME hasar ve myogenesis, ikna etmek için BaCl2 myotoxin yaralanma sonra biz yaklaşık % 5, % 26, % 26 ve % 43 tek konak TA kas liflerinin göstermek hiçbir ana bilgisayar katkı, en az ana bilgisayar katkı, orta ana bilgisayar onaylamak katkı ve en büyük katkısı, sırasıyla ev sahipliği. Merkez çekirdekleşme (dejenerasyon ve sonraki rejenerasyon bir işaretleyici) TA kas lifleri yaklaşık % 95 MIME ve myotoxin enjeksiyon sonra görülür.
Rejenere lifler çoğunluğu merkezi olarak parçalanmayabilir zaman bu zaman noktası rejenerasyon, ara sahne yakalar çünkü MIME + BaCl2 ‘ den sonra 14 gün TA kas inceleriz. Böylece biz sonunda ana bilgisayar fare insan Kadavra kas nakli ne zaman biz kas lifleri ana bilgisayar ve donör kökenli kolayca ayırt edebilecektir için MIME, konukçu GFP + fare inceleriz. Bu kas lifleri tek TA kas9‘ dan büyük myogenic potansiyel göstermiştir bu yana fareyi Edi kas deneysel donör doku kullanın. Edi kas da TA kas sinerjik ve benzer fiber türü kompozisyon vardır. Ön verilerimiz MIME donör-hücre kaynaklı myogenesis ana kas kolaylaştırmak yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.
Burada, donör kas dokusu ana kas dokusuna implant MIME, bizim laboratuvarda geliştirilen olarak bilinen roman deneysel tekniği için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Bu zaten bir ana kas9,10,17myogenesis donör-Hücre-aracılı teşvik etkili olduğu kanıtlanmıştır tekniği aşılama açık bir kas bir uyarlamasıdır.
MIME donör kas dokusuna kendisi (biz şu anda bu oluşup oluşmayacağını bilmiyorum) ana kas engraftment etkinleştirmemeyi ama oldukça myogenesis m teşvik koşullar altında ana kas katkıda bulunabilir SCs donör kaynağı sağlamak için hedeftir uscle rejenerasyon. Umudumuz MIME en iyi duruma getirilmiş ve temel ve preklinik çalışmalarda test sonra klinik tedaviler myogenic kas kaybı geçirmiş iskelet kasları kas rejenerasyon artırmaya yönelik rehberlik için değerli bilgiler sağlayabilir.
Nasıl MIME klinik bir terapiye örneğin tercüme edilebilir ile ilgili olarak cevaplanması için henüz çok sayıda sorular: nasıl donör doku kalitesini denetlemek? Nasıl donör doku ve hücreleri bağışıklık reddi kontrol? Donör doku hücreleri myogenesis için sağladıktan sonra temizlenir veya fibrotik bir yara izi mi? Donör ve/veya ana kas lif türü donör-Hücre-aracılı myogenesis etkiler mi? Hangi kas pratik olarak MIME seçeneğinden yararlanabilir? Şu anda çalışmalarımız MIME güvenli ve etkili olup olmadığını değerlendirmek, donör kaynaklı myogenesis artırmak ve yukarıda listelenen soruları, birçoğu cevap ek tedaviler tanımlamak için arttırıyoruz.
Fare fare allojeneik nakli MIME testlerimiz tamamladıktan sonra sonraki adım kadavra kas dokusu myogenic potansiyelini değerlendirmek için insan fare MIME kadavra insan dokusu ile gerçekleştirmektir. Biz bu deneyler bağışçılardan eğitim için vücut miras programı ve organ bağışı hayat hediye programı gibi girişimleri içinde kayıtlı kas dokusu içeren temel ve translasyonel araştırma, yeni bir satır sağlayacaktır tahmin .
Bu el yazması sunulan temsilcisi verinin MIME sonra 14 gün GFP eksikliği veya GFP düşük düzeyine sahip birkaç uygun myofibers olduğunu düşündürmektedir. Bu veriler bizim yorum GFP-donör uydu hücrelerin ana kas myogenesis katkıda olduğunu. Bir ana bilgisayar fare kas içine insan Kadavra doku implantasyon için hazırlık Bu deney yapılır. Tümden donör uydu hücreleri MIME aşağıdaki ana kas myogenesis katkıda göstermek için (örneğinGFP kolayca ayırt edilebilir, floresan bir muhabir ifade donör doku implantı yararlı olacaktır Kırmızı floresan protein) donör doku GFP + ana kas içine implante ifade.
Bu teknik özellikle SCs donör dokuda mevcut doğası ile sınırlıdır. SCs donör doku tekniğidir donör-Hücre-aracılı myogenesis kolaylaştırmak için büyük olasılıkla uygun iseniz, eğer onlar are değil uygun, myogenesis gerçekleşemez tamamlayın. SCs çok esnektir ve yaklaşık 2 hafta otopsi için uygun beri Ancak, deneysel amaçlar için donör-Hücre-aracılı myogenesis13 hasat sonra birkaç dakika içinde implante donör doku kolaylaştıracaktır görüneno ki . Ayrıca, yukarıdaki için sorar gibiydi (içeren SCs, olgun kas lifleri yanı sıra kas yerleşik fibroblastlar) tüm kas dokusu beri fibrozis oluşabilir ana kas gömülü mümkündür. Ancak, bu varsayımı ampirik olarak incelenmesi gereken. Zararlı kasılmalar, cryoinjury ve deneysel myotoxins kaynaklanan kas hasarı edebiyat bağışıklık hücreleri (esas olarak makrofajlar) etkili bir şekilde hasarlı liflerinden hücresel enkaz açıklıkta ve remodeling yeteneğine olduğunu göstermektedir hücre dışı matriks18. Bu nedenle, ana bilgisayar bağışıklık hücreleri donör kas lifleri, oluşan bozucu erişiminiz olduğu sürece MIME ve BaCl2 enjeksiyon sonra onlar sadece donör SCs bırakarak enkaz, açık mümkündür. Son olarak, donör kaynaklı myogenesis ölçüde ana kas gömülü donör kas dokusu miktarına bağlıdır. Sırayla tamamen donör-hücre kaynaklı myofibers tarafından yeniden yerleştirilmesi ana kas yuvası, bir yöntem gibi X – veya gama-ana kas SCs ablate ve aynı zamanda tekrarlanan MIME yordamlar gerektirir için Işınlama gerektirecektir.
Cerrahi olarak ana kas teşhir ve donör doku ana kas üzerine bir parça dikiş donör-Hücre-aracılı myogenesis9,10,17kolaylaştırabilir kanıtlanmıştır. Bu açık cerrahi yaklaşım geçmişte myogenesis ilerlemesini izlemek ve insan kas hastalıkları fare modelleri oluşturmak için kullanılmıştır. MIME tekniğin yenilikçi fark minimal invaziv ve cerrahi olarak ana kas açığa anlamına gelmez yönüdür. Bu iyatrojenik enfeksiyon ve bu nedenle yapım o MIME tekrar tekrar gerekirse aynı ana kas üzerinde gerçekleştirmek için daha uygun konak hayvan rahatsızlık derecesine riskini azaltır.
Biz MIME tekniği uygun bir arıtma şu anda donör kas dokusu bir ana bilgisayar fare implant takip açık cerrahi yaklaşım olabilir tahmin. Bu ana bilgisayar fare kas biyopsi insan kas gömerek insanlaşmış fare modellerin üretimi hızlandırmak. Ayrıca, fare fare aşılama üzerinden bizim ön verilere dayanarak, MIME donör SCs olduğu sürece uygun donör-Hücre-aracılı myogenesis insan Kadavra donör dokusundan ulaşmada etkili olacaktır tahmin. Son olarak, ek sınama ve doğrulama ile biz MIME tekniği donör-Hücre-aracılı myogenesis kas hastalığı olan insanlarda kolaylaştırmak için yeni tedaviler geliştirmek yardımcı olacağını umuyoruz.
MIME teknik başarısı tam olarak donör doku ana kas Fasial yuvası (epimysium) içinde katıştırma üzerine eleştirel bağlıdır. Sadece donör doku ana kas bölme içinde yerleştirilmiş olması durumunda, kesin bir biçimde ana kas SCs sağlamak mümkün olacaktır. Donör doku dışında ana kas yerleştirilmiş olması durumunda, onun kaderi ne olurdu olarak belli değil. Ondan beri onun’önemli ve yüzeysel olarak yerleştirilmiş bacağın anterolateral yönüyle MIME için bizim deneysel modelinde, biz ana kas TA kas kullanın. Boyutunu, yönünü ve anatomik TA kas konumunu donör doku doğru MIME sonra konak TA kas içinde yerleştirilir onaylamak yapmayı kolaylaştırır. Bu yazıda, biz deneysel kanıt sağladı bu donör doku yenidendonör-Hücre-aracılı myogenesis ana kas 14 gün sonrası MIME, konak TA kas 3 gün sonrası MIME ve bu orada gömülü şebeke var.
The authors have nothing to disclose.
Bu eser bir Pilot Grant tarafından İttifak’ın rejeneratif rehabilitasyon araştırma ve eğitim (AR3T) ve öğretim başlangıç paketi için Wayne State Üniversitesi kavanoz için mümkün yapıldı. AR3T Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü çocuk sağlığı ve insan geliştirme (NICHD), sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur (NINDS) ve Ulusal Enstitüsü, Biyomedikal görüntüleme ve Biyomühendislik (NIBIB tarafından desteklenmektedir ), Ulusal Ödülü numarası P2CHD086843 altında sağlık Enstitüleri. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor.
NSG-GFP mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #021937 | Immunodeficient host mice that ubiquitously express green fluorescent protein |
C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) | Stock #000664 | Control donor mice |
Tabletop isoflurane vaporizer | VetEquip (Livermore, CA) | Item #901801 | Inhaled anesthesia system |
Magic depilatory crea | Softsheen Carson (New York, NY) | N/A | Razorless hair removal cream |
4-0 Silk, black, braided, non-absorbable sutures | Roboz Surgical Instrument Co, Inc. (Gaithersburg, MD) | SUT106631 | Guiding sutures for donor tissue |
VetBond veterinary tissue adhesive | 3M (Maplewood, MN) | Catalog #1469Sb | Veterinary tissue adhesive for sutureless skin closure |
Barium chloride | Ricca Chemical Company (Arlington, TX) | Product #R0854000-500A 854-16 | Myotoxin to induce muscle damage and stimulate regeneration |
Deltaphase isothermal gel heating pad | Braintree Scientific (Braintree, MA) | Item #39DP | Heating pad to provide thermal support to animals while under anesthesia |
HM525NX cryostat | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog #HM525NX | Cryostat to make frozen sections of muscle |
Vectashield Antifade Medium | Vector Laboratories, Inc. (Burlingame, CA) | Catalog Number: H-1000 | Antifade medium to preserve fluorescence in immunofluorescently labeled samples |
Rabbit anti Desmin Antibody | Labvision Thermo Scientific (Fremont, CA) | RB9014P | Rabbit anti desmin antibody for desmin immunofluorescent labeling |
Goat anti Rabbit Alexa 568 Antibody | ThermoFisher (Waltham, MA) | Catalog#: A-21069 | Goat anti rabbit secondary antibody for desmin immunofluorescent labeling |
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Seracare (Milford, MA) | Catalog #5930-0006 or 71-03-01 | Reagent for fluorescent labeling of nuclei |
Axio Scope.A1 microscope | Carl Zeiss (Peabody, MA) | Product #Axio Scope.A1 | Light and fluorescence microscope |
Photoshop CS4 | Adobe Systems (San Jose, CA) | Photoshop CS4 | Imaging Software for perform image tiling |
Image J | National Institutes of Health (Bethesda, MD) | Image J for Windows 64-bit Operating System | Imaging Software for quantitative fluorescence analysis |