Vi introduserer et nytt hypokalsystem for bruk med vannlevende organismer som frosk og sebrafiskembryoer. Vårt system er enkelt, robust, kostnadseffektivt og muliggjør induksjon og opprettholdelse av hypoksi in vivo og i opptil 48 timer. Vi presenterer 2 reproduserbare metoder for å overvåke effekten av hypoksi.
Her introduserer vi et nytt system for hypoksi-induksjon, som vi utviklet for å studere effekten av hypoksi i akvatiske organismer som frosk og sebrafiskembryoer. Vårt system består av et kammer som har et enkelt oppsett som likevel er robust til å indusere og opprettholde en bestemt oksygenkonsentrasjon og temperatur i en hvilken som helst eksperimentell løsning. Det presenterte systemet er svært kostnadseffektivt men svært funksjonelt, det tillater induksjon og opprettholdelse av hypoksi for direkte eksperimenter in vivo og i ulike tidsperioder opptil 48 timer.
For å overvåke og studere effekten av hypoksi har vi benyttet to metoder – måling av nivåer av hypoksi-inducerbar faktor 1alpha (HIF-1α) i hele embryoer eller spesifikke vev og bestemmelse av retinalt stamcelleproliferasjon med 5-etynyl-2'- Deoxyuridin (EdU) inkorporering i DNA. HIF-1α nivåer kan tjene som en generell hypoksi markør i hele embryoet eller vevetAv valg, her embryonalt nese. EdU-inkorporering i de prolifererende celler av embryonalt retina er en spesifikk utgang av hypoksi-induksjon. Dermed har vi vist at hypoksiske embryonale retinale progenitorer reduserer proliferasjon innen 1 time inkubering under 5% oksygen av både frosk og zebrafiskembryoer.
Når vi har mestret, kan vårt oppsett brukes til bruk med små organismer av vannmodell, for direkte in vivo eksperimenter, i en gitt tidsperiode og under normal, hypoksisk eller hyperoksisk oksygenkonsentrasjon eller under en hvilken som helst annen gitt gassblanding.
Hypoksiforskning har mange anvendelser. Disse inkluderer undersøkelse av patogenesen og utvikling av behandlinger for medisinske tilstander preget av hypoksi 1 og akutt høyhøye sykdom 2 . Hypoksisk stress forårsaker store metabolske forandringer i alle organismer som krever oksygen. Hypoksisk stress påvirker også føtal vekst og utvikling og patogenesen av flere humane sykdommer, inkludert intrauterin vekstrestriksjon 3 . Hypoksisk stress kan ikke bare føre til redusert fødselsvekt, føtal og nyfødt dødelighet, men kan også resultere i mange komplikasjoner i voksenlivet, for eksempel kardiovaskulær sykdom, type 2 diabetes, fedme og hypertensjon 4 . Hypoksisk stress blir også ofte observert under solid tumorutvikling, når svulstvevet vokser ut blodtilførselen. Det er derfor viktig å kunne studere effekten av hypoksi in vivo og direkte under embr Yonisk utvikling.
Blant de mest kjente metoder som har vært ansatt for å studere effekter av hypoksi under utvikling er bruken av koboltklorid i vekstmediet eller inkubasjon av organismen i et hypoksisk kammer. Kobolklorid fremkaller kunstig en hypoksisk respons under normal oksygenkonsentrasjon, på grunn av sin rolle i stabiliseringen av hypoksi-inducerbar faktor-1 alfa (HIF-1a) ved å forhindre dets proteosomale nedbrytning 5 , 6 , 7 . Imidlertid, som en praktisk metode 8 , kan bruken av koboltklorid samt andre lignende kjemiske hypoksymimetika ha uspesifisert skadelig virkning på celler og vev, for eksempel apoptose 9 . Derfor er hypoksiske kamre en bedre metode for induksjon av "naturlig hypoksi" i levende organismer i løpet av normal utvikling.
Ntent "> Vi har fokusert på å utvikle et system for induksjon av hypoksi i akvatiske embryoer. Både frosker og sebrafisk har nå blitt informative vertebratmodellorganismer for studier av mange biologiske prosesser, samt modeller for ulike menneskersykdommer. Frog- og sebrafiskembryoer Utvikle seg eksternt, eliminere komplikasjonen av maternell kompensasjon. Videre gjør et raskt utviklingsløp det mulig å manipulere miljøfaktorer og observere fenotypiske forandringer i organdannelsen i sanntid. I tillegg er mange komponenter i de store signaltransduksjonsbanene sterkt konserverte i Disse modellorganismer og har blitt karakterisert i detalj av en stor litteratur. Hovedfordelen ved bruk av frosker og zebrafiskembryoer for å studere effekten av hypoksi på vertebratutvikling er at alle prosesser kan overvåkes direkte, siden oksygen raskt trenger inn i embryoene. Dermed i frosker og sebrafisk, som i motsetning til andre modellorganismer somMusembryoer, kan påvirkning av en bestemt oksygenkonsentrasjon studeres i vev av interesse uten å ta hensyn til forekomsten eller mangelen på funksjonell vaskulatur.De fleste kommersielt tilgjengelige oppsett for hypoksisk inkubasjon har ulempen ved å være sammenlignbart store og har tilsvarende høye løpekostnader. Bortsett fra deres høye initialkostnad og gassforbruk krever ekvilibrering og vedlikehold av vanlige hypoksiekamre opprettholdelse av konstant hypoksisk atmosfære mot gassgradienten som naturlig forekommer i disse kamrene på grunn av deres større størrelse og / eller organisasjonsånding. Dette krever sysselsetting av gassfans og et kjølesystem, noe som øker mengden ekstra nødvendig utstyr, hindrer forskers fingerfylling og generelt reduserer enkelheten i eksperimentell prosedyre. I motsetning til dette er oppsettet vi presenterer her, sammenlignbart robust, men svært kostnadseffektivt, lite, lett å etablere og tillater fAst-gassekvilibrering, stabil hypoksisk atmosfære og enkel utveksling av materialer og løsninger i kammeret. Vårt system kan brukes til bruk med en vannmiljøorganisme av interesse.
Vi har konstruert et hypoksisk kammer som er bekvemt lite og kan derfor plasseres inne i en felles laboratorieinkubator, som lett tillater eksperimentelle prosedyrer ved en bestemt temperatur. For å gi praktisk kontroll over både temperatur og oksygenkonsentrasjon i mediet ligger fordelen av systemet vårt mot de kommersielt tilgjengelige hypoksi-inkubatorene i sin lille størrelse og kostnadseffektivitet. Dermed kan vårt oppsett etableres ved hjelp av generelle laboratorieforsyninger tilgjengelig for de fleste forskningslaboratorier og krever ikke dyre materialer. I tillegg genererer oppsettet ikke varme, i motsetning til kommersielt tilgjengelige hypoksi-inkubatorer, og tillater bruk ved temperaturer lavere enn romtemperaturen blir plassert i en inkubator. LaSt er spesielt kritisk for arbeidet med kaldblodige organismer som frosker og fisk der utviklings- og metabolskrate er sterkt temperaturavhengige.
Å være svært kostnadseffektiv og lett bygget, er vårt gassinkubasjonskammer likevel svært allsidig når det gjelder å etablere ulike hypoksiske eller hyperoksiske forhold, samt muliggjøre rask og enkel administrasjon av forskjellige medier og løsninger for et stort antall eksperimentelle forhold. I tillegg bruker vi en brønn på 24 brønner i stedet for vanlige retter eller laboratorietanker 10 , 11 , 12 , og lar oss observere og eksperimentelle behandling av flere mutantforhold samtidig.
For å kontrollere for korrekt induksjon av hypoksi, har vi overvåket nivåene av HIF-1a-proteinet ved Western blot-deteksjon. I tillegg er antallet prolifererende celler før og etter inkubasjonN i det hypoksiske kammeret kan brukes til å avgjøre om hypoksi har blitt indusert i vevet. Denne metoden er basert på våre tidligere publiserte resultater 13 , som viser at spredning i embryonal retinal stamcelle nisje reduseres ved induksjon av hypoksi. Dermed har vi overvåket nivået av retinalt stamcelleproliferasjon ved å tilsette 5-etynyl-2'-deoksyuridin (EdU) til embryo-mediumet og måle dets innlemmelse i DNA'et av nylig prolifererende celler.
Her har vi presentert en enkel, men robust ny metode for å indusere hypoksi som er justert for bruk med frosk- og sebrafiskembryoer, men kan også være egnet for andre akvatiske organismer. Den største fordelen med denne metoden ligger i sin enkelhet og kostnadseffektivitet. Likevel er resultatene oppnådd med denne metoden svært robuste. Vi har vist at hypoksi kan effektivt framkalles i kammeret både i hele embryoer og i spesifikt vev – her, retina. For å fastslå effektiviteten av hypoksi-induksjonen har vi over…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Support from Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z til WAH og DFG fellesskapet KH 376 / 1-1 tildelt HK
Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |