אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

מחקר Hypoxia יש יישומים רבים. אלה כוללים לחקור את הפתוגנזה ולפתח טיפולים למצבים רפואיים המאופיינים בהיפוקסיה ¹ ומחלת גבהים גבוהה ² . מתח היפוקסי גורם לשינויים מטבוליים משמעותיים בכל האורגניזמים הדורשים חמצן. הלחץ ההיפוקסי משפיע גם על התפתחות העובר ועל התפתחות המחלה ועל מספר מחלות אנושיות, כולל הגבלת צמיחה תוך רחמית. מתח היפוסי אינו יכול רק לגרום לירידה במשקל הלידה, לתמותה בעובר ולילוד, אלא גם לגרום לסיבוכים רבים בחיים הבוגרים, כגון מחלות לב וכלי דם, סוכרת מסוג 2, השמנת יתר ויתר לחץ דם ⁴ . לחץ היפוקסי הוא גם נצפה לעתים קרובות במהלך התפתחות הגידול מוצק, כאשר רקמת הגידול מתגבר אספקת הדם שלה. לכן חיוני כדי להיות מסוגל ללמוד את ההשפעות של היפוקסיה in vivo ו ישירות במהלך embr יונית פיתוח.

בין השיטות הידועות ביותר אשר הועסקו במחקר ההשפעות של היפוקסיה במהלך הפיתוח הוא השימוש של כלור קובלט במדיום הצמיחה או הדגירה של האורגניזם בחדר היפוקסי. קובלט כלוריד גורם באופן מלאכותי תגובה היפוקסית תחת ריכוז החמצן הרגיל, בשל תפקידה בייצוב של גורם היפוקסיה גורם 1 אלפא (HIF-1α) על ידי מניעת השפלה פרוטאוזומלית שלה ^{5 , 6 , 7} . עם זאת, להיות שיטה נוחה ⁸ , את השימוש של כלוריד קובלט, כמו גם אחרים דומים היפוקסיה כימית mimetics יכול להיות השפעה מזיקה unspecific על תאים ורקמות, למשל , אפופטוזיס ⁹ . לכן, תאים hypoxic הם שיטה טובה יותר עבור אינדוקציה של "היפוקסיה טבעית" באורגניזמים חיים במהלך ההתפתחות הרגילה.

"אנחנו מתמקדים בפיתוח מערכת לאינדוקציה של היפוקסיה בעוברי בעלי חיים ימיים, הן צפרדעים והן דג הזברה הפכו כעת לאורגניזמים של מודל חוליות אינפורמטיבי למחקרים על תהליכים ביולוגיים רבים, כמו גם מודלים למחלות שונות של בני אדם.צפרדעים ועופות דג הזברה מתפתחת חיצונית ומבטלת את הסיבוך של הפיצוי האימהי.כמובן, מסלול מהיר של פיתוח מאפשר לתמרן גורמים סביבתיים ולבחון את השינויים פנוטיפי של היווצרות איברים בזמן אמת.בנוסף, מרכיבים רבים של מסלולי התמרת האות העיקריים נשמרים מאוד ב אלה אורגניזמים מודל מאופיינים בפירוט על ידי גוף גדול של הספרות.היתרון העיקרי באמצעות צפרדעים ועובדי דג הזברה ללמוד את ההשפעות של היפוקסיה על התפתחות החולייתנים היא שכל התהליכים ניתן לפקח ישירות, שכן החמצן חודר במהירות העוברים. לפיכך, צפרדעים דג הזברה, בניגוד אורגניזמים מודל אחרים כגוןעכברים העכבר, ההשפעה של ריכוז חמצן מסוים ניתן ללמוד רקמות של עניין, מבלי לקחת בחשבון את נוכחות או חוסר של כלי הדם תפקודית.

רוב setups זמין מסחרית עבור הדגירה hypoxic יש את החיסרון להיות גדול יחסית ויש עלויות ריצה גבוהות בהתאמה. מלבד העלות הראשונית הגבוהה שלהם וצריכת הגז, שיווי משקל ותחזוקה של תאי היפוקסיה נפוצים מחייבת שמירה על אווירה היפוקסית מתמדת כנגד התדרדרות הגז המתרחשת באופן טבעי בתאי אלה בגלל הגודל הגדול יותר ו / או הנשימה של האורגניזם. זה דורש תעסוקה של מאווררי גז ומערכת קירור, אשר מגדיל את כמות הציוד הדרוש נוסף, מעכב את המיומנות של החוקר הכוללת מקטין את הפשטות של הליך ניסיוני. לעומת זאת, את ההתקנה אנו מציגים כאן הוא חזק יחסית, אבל מאוד חסכונית, קטן, קל להקים ומאפשר fאסט גזיזת גז, אווירה hypoxic יציב חילופי פשוט של חומרים ופתרונות בתוך החדר. המערכת שלנו יכול להיות מועסק לשימוש עם כל אורגניזם מודל ימיים של עניין.

בנינו תא hypoxic כי הוא קטן בנוחות ולכן ניתן להציב בתוך חממה משותפת, אשר בקלות מאפשר הליכים ניסיוניים בכל טמפרטורה מסוימת. מתן שליטה נוחה בטמפרטורה כמו גם ריכוז החמצן במדיום, היתרון של המערכת שלנו נגד חממות היפוקסיה זמין מסחרית טמון בגודלו הקטן ויעילות העלות. לפיכך, ההתקנה שלנו ניתן להקים באמצעות ציוד מעבדה כללית זמין עבור רוב המעבדות מחקר אינו דורש שום חומרים יקרים. בנוסף, ההתקנה שלנו אינה מייצרת חום, בניגוד החסרונות זמינים מסחרית היפוקסיה, ומאפשר להשתמש בטמפרטורות נמוכות יותר בטמפרטורת החדר להיות ממוקם באינקובטור. להSt הוא קריטי במיוחד עבור העבודה עם אורגניזמים קר דם כגון צפרדעים ודגים שבו שיעורי התפתחותיים מטבוליים תלויים מאוד בטמפרטורה.

להיות מאוד חסכונית ובנו בקלות, החדר הדגירה שלנו הוא עדיין תכליתי מאוד בהקמת שונים hypoxic או hyperoxic התנאים, כמו גם המאפשר מהיר וקל הממשל של מדיה שונים ופתרונות עבור מספר עצום של תנאי הניסוי. בנוסף, באמצעות צלחת 24-היטב במקום מנות נפוץ או טנקים מעבדה ^{10 , 11 , 12} , המערכת שלנו מאפשרת תצפית וטיפול ניסיוני של כמה תנאים מוטציה בבת אחת.

כדי לשלוט על אינדוקציה נכונה של היפוקסיה, יש לנו פיקוח על רמות של חלבון HIF-1α על ידי זיהוי כתם המערבי. בנוסף, מספר תאים מתרבים לפני ואחרי incubatioN בחדר היפוקסי ניתן להשתמש כדי לקבוע אם היפוקסיה כבר המושרה ברקמה. שיטה זו מבוססת על התוצאות שפורסמו בעבר ^{13 שלנו} , מראה כי התפשטות עובריים בגזע נישה בתאי ניוון פוחתת על אינדוקציה של היפוקסיה. לכן, יש לנו פיקוח על רמת התפשטות תא גזע הרשתית על ידי הוספת 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) למדיום העובר ומדידת שילובו לתוך ה- DNA של תאים חדשים התפשטות.