Vi introducerer et nyt hypoxisk kammersystem til brug sammen med vandorganismer som frog og zebrafish embryoner. Vores system er enkelt, robust, omkostningseffektivt og muliggør induktion og vedligeholdelse af hypoxi in vivo og i op til 48 timer. Vi præsenterer 2 reproducerbare metoder til overvågning af effektiviteten af hypoxi.
Her introducerer vi et nyt system til hypoxi induktion, som vi udviklede til at studere hypoxiets virkninger i vandlevende organismer som frog og zebrafish embryoner. Vores system består af et kammer med en simpel opsætning, som alligevel er robust til at fremkalde og opretholde en specifik iltkoncentration og -temperatur i en hvilken som helst forsøgsopløsning. Det præsenterede system er meget omkostningseffektivt men meget funktionelt, det tillader induktion og vedligeholdelse af hypoxi til direkte forsøg in vivo og i forskellige tidsperioder op til 48 timer.
For at overvåge og undersøge virkningerne af hypoxi har vi brugt to metoder – måling af niveauer af hypoxi-inducerbar faktor 1alpha (HIF-1α) i hele embryoner eller specifikke væv og bestemmelse af retinalt stamcelleproliferation med 5-ethynyl-2'- Deoxyuridin (EdU) inkorporering i DNA'et. HIF-1a niveauer kan tjene som en generel hypoxi markør i hele embryoet eller vævetEfter eget valg, her embryonalt nethinden. EdU inkorporering i de proliferative celler af embryonalt retina er en specifik udgang af hypoxi induktion. Således har vi vist, at hypoxiske embryonale retinale forfædre reducerer proliferation inden for 1 time inkubation under 5% oxygen af både frø og zebrafiskembryoner.
Når vi har mestret, kan vores opsætning anvendes til brug med små vandmiljøorganismer, til direkte in vivo forsøg, en given tidsperiode og under normal, hypoxisk eller hyperoxisk iltkoncentration eller under en anden given gasblanding.
Hypoxi forskning har mange anvendelser. Disse omfatter undersøgelse af patogenesen og udvikling af behandlinger for medicinske tilstande præget af hypoxi 1 og akut højhøjde sygdom 2 . Hypoksisk stress forårsager større metaboliske forandringer i alle organismer, der kræver ilt. Hypoksisk stress påvirker også fostervækst og udvikling og patogenesen af adskillige humane sygdomme, herunder intrauterin vækstrestriktion 3 . Hypoksisk stress kan ikke kun føre til nedsat fødselsvægt, føtal og neonatal dødelighed, men kan også resultere i mange komplikationer i voksenlivet, såsom kardiovaskulær sygdom, type 2 diabetes, fedme og hypertension 4 . Hypoksisk stress observeres også ofte under udvikling af fast tumor, når tumorvævet vokser blodforsyningen. Det er derfor afgørende at kunne studere virkningerne af hypoxi in vivo og direkte under embr Yonisk udvikling.
Blandt de mest kendte metoder, som har været anvendt til at studere virkninger af hypoxi under udvikling, er brugen af koboltchlorid i vækstmediet eller inkubation af organismen i et hypoxisk kammer. Cobaltchlorid inducerer kunstigt en hypoxisk reaktion under normal oxygenkoncentration på grund af sin rolle i stabiliseringen af hypoxi-inducerbar faktor-1 alpha (HIF-1a) ved at forhindre dens proteosomal nedbrydning 5 , 6 , 7 . Imidlertid er anvendelsen af koboltchlorid såvel som andre lignende kemiske hypoximimetika en uegnet, skadelig virkning på celler og væv, f.eks . Apoptose 9 , som en bekvem metode 8 . Derfor er hypoxiske kamre en bedre metode til induktion af "naturlig hypoxi" i levende organismer gennem normal udvikling.
Ntent "> Vi har fokuseret på at udvikle et system til induktion af hypoxi hos akvatiske embryoner. Både frøer og zebrafisk er nu blevet informative hvirveldyrmodellorganismer til studier af mange biologiske processer samt modeller for forskellige menneskelige sygdomme. Frog- og zebrafiskembryoner Udvikle eksternt, eliminere komplikationen af maternisk kompensation. Et hurtigt udviklingsforløb gør det også muligt at manipulere miljøfaktorer og observere de fænotypiske ændringer i organdannelsen i realtid. Desuden er mange komponenter af de store signaltransduktionsveje stærkt bevaret i Disse modelorganismer og er blevet karakteriseret i detaljer af en stor mængde litteratur. Hovedfordelen ved at bruge frøer og zebrafiskembryoner til at undersøge virkningerne af hypoxi på udviklingen af hvirveldyr er, at alle processer kan overvåges direkte, da oxygen hurtigt trænger ind i embryonerne. Således i frøer og zebrafisk, som i modsætning til andre modelorganismer som f.eksMusembryoer, kan indflydelsen af en specifik iltkoncentration undersøges i det væv af interesse uden at tage hensyn til tilstedeværelsen eller manglen på funktionel vaskulatur.De fleste kommercielt tilgængelige opsætninger til hypoxisk inkubation har den ulempe, at de er sammenligneligt store og har tilsvarende høje løbende omkostninger. Bortset fra deres høje indledende omkostninger og gasforbrug kræver ækvilibrering og vedligeholdelse af almindelige hypoxikamre en konstant hypoxisk atmosfære imod gasgradienten, som naturligt forekommer i disse kamre på grund af deres større størrelse og / eller organismernes åndedræt. Dette kræver ansættelse af gasfans og et kølesystem, hvilket øger mængden af yderligere nødvendigt udstyr, forhindrer forskers fingerfærdighed og generelt reducerer enkelheden af forsøgsproceduren. I modsætning hertil er opsætningen vi præsenterer her sammenligneligt robust, men meget omkostningseffektiv, lille, let at etablere og tillader fAst gas-ækvilibrering, stabil hypoxisk atmosfære og simpel udveksling af materialer og opløsninger inde i kammeret. Vores system kan anvendes til brug med enhver vandmiljøorganisme af interesse.
Vi har konstrueret et hypoxisk kammer, der er bekvemt lille, og kan derfor placeres inde i en fælles laboratorieinkubator, som let giver eksperimentelle procedurer til enhver bestemt temperatur. Fordelene ved vores system mod de kommercielt tilgængelige hypoxi-inkubatorer ligger bekvemt i kontrol med temperaturen såvel som iltkoncentrationen i mediet, idet den er lille størrelse og omkostningseffektivitet. Således kan vores opsætning etableres ved hjælp af generelle laboratorieforsyninger til rådighed for de fleste forskningslaboratorier og kræver ikke nogen dyre materialer. Derudover genererer vores opsætning ikke varme, i modsætning til de kommercielt tilgængelige hypoxi-inkubatorer, og tillader brug ved temperaturer, der er lavere end stuetemperatur, der anbringes i en inkubator. LaSt er særligt kritisk for arbejdet med koldblodede organismer som frøer og fisk, hvor udviklings- og metaboliske satser er stærkt temperaturafhængige.
At være meget omkostningseffektiv og let opbygget er vores gasinkubationskammer alligevel meget alsidigt ved etablering af forskellige hypoxiske eller hyperoxiske forhold samt mulighed for hurtig og nem administration af forskellige medier og løsninger til et stort antal eksperimentelle forhold. Derudover tillader vores system at anvende en brønd med 24 brønde i stedet for almindeligt anvendte tallerkener eller laboratorietanke 10 , 11 , 12 og observation og eksperimentel behandling af flere mutante forhold på én gang.
For at kontrollere for korrekt induktion af hypoxi har vi overvåget niveauerne af HIF-1a-proteinet ved Western blot-detektion. Derudover er antallet af proliferative celler før og efter inkubationN i det hypoksiske kammer kan bruges til at bestemme, om hypoxi er blevet induceret i vævet. Denne metode er baseret på vores tidligere offentliggjorte resultater 13 , der viser, at spredning i embryonal retinal stamcelle niche falder ved induktion af hypoxi. Således har vi overvåget niveauet af retinal stamcelleproliferation ved at tilsætte 5-ethynyl-2'-deoxyuridin (EdU) til embryomediet og måle dets inkorporering i DNA'et af nyudbredende celler.
Her har vi præsenteret en nem, men robust ny metode til at fremkalde hypoxi, der er indstillet til brug med frø- og zebrafiskembryoner, men kan også være egnet til andre vandlevende organismer. Den største fordel ved denne metode ligger i dens enkelhed og omkostningseffektivitet. Ikke desto mindre er de opnåede resultater med denne metode meget robuste. Vi har vist, at hypoxi effektivt kan induceres i kammeret både i hele embryoner såvel som i specifikt væv – her er retina. For at bestemme effektiviteten af …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Support from Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z til WAH og DFG-stipendiet KH 376 / 1-1 tildelt HK
Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl / 0.1X MBS, Embryo medium, 10X TBST |
Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl / 0.1X MBS, Embryo mediu, |
Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3 / 0.1X MBS |
HEPES | Sigma | H3375 | 0.1X MBS |
Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4 / 0.1X MBS, Embryo medium |
Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca (NO3)2 / 0.1X MBS |
Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2 / 0.1X MBS, Embryo medium |
Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
Pregnant mare serum gonadotropin | Sigma | CG10 | frog fertilization |
Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | gas chamber construction |
24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | gas tank attachment (Schema 1, I) |
5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | hypoxic gas mixture |
ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | hypoxic chamber setup |
fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | hypoxic chamber setup |
plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | for embryo transfer |
MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | embryo anesthetic |
RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | tissue homogenization |
Protease inhibitor | Sigma | P8340 | tissue homogenization |
Tris | Sigma | 77-86-1 | 4X Laemmli loading buffer, 10X TBST |
Glycerol | Sigma | G5516 | 4X Laemmli loading buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L3771 | SDS, 4X Laemmli loading buffer, 5X Running buffer |
beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4X Laemmli loading buffer |
Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4X Laemmli loading buffer |
Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
Glycine | Sigma | G8898 | 5X Running buffer, Transfer buffer |
Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10X TBST |
skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | tissue homogenization |
pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | tissue homogenization |
precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
Phosphate-buffered Saline | Oxoid | BR0014G | 1X PBS |
Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
Heat-inactivated Goat Serum | Sigma | G6767-100ml | HIGS, Blocking solution (EdU incorporation) |
4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
Dimethyl sulfoxide | Molecular Probes | C10338 | DMSO, EdU incorporation |
glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | embedding medium, EdU incorporation analysis |
cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
FluorSave | Calbiochem | D00170200 | mounting medium, EdU incorporation analysis |
coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |