Summary

Çevresel İpuçlarının Eklem Davranışı Üzerine Etkisini Test Etmek İçin Bir Yöntem<em> Drosophila melanogaster</em

Published: July 17, 2017
doi:

Summary

Drosophila melanogaster meyve sinekinde çiftleşme davranışını etkileyen çevresel ve genetik ipuçlarını analiz etmeye yönelik bir analiz yapacağız.

Abstract

Bir kişinin cinsel gücü, genotip, deneyim ve çevresel koşullardan etkilenir. Bu faktörlerin cinsel davranışları modüle etmek için nasıl etkileşim kurdukları çok iyi anlaşılmamıştır. Drosophila melanogasterında , besin mevcudiyeti gibi çevresel ipuçları, cinsel davranışları modüle eden mekanizmaları araştırmak için uyumlu bir sistem sunan çiftleşme aktivitesini etkiler. D. melanogaster'da çevresel ipuçları genellikle kemoterapi tatlısı ve koku sistemleriyle algılanır. Burada, çevresel kimyasal ipuçlarının çiftleşme davranışı üzerindeki etkisini test etmek için bir yöntem sunuyoruz. Tahlil, besin ortamı ve çift çift içeren küçük bir çiftleşme arenasından oluşur. Çiftler için çiftleşme frekansı 24 saat süreyle sürekli olarak izlenir. Burada, bu tahlilin çevresel bileşenleri basınçlı bir hava sistemi vasıtasıyla harici bir kaynaktan denemek için uygulanabilirliğini ve çevresel bileşenlerin doğrudan çiftleşme arenasında manipüle edilmesini sunuyoruz. SenBasınçlı bir hava sisteminin bileşimi, çok uçucu bileşiklerin etkisini test etmek için özellikle faydalıdır, oysa doğrudan eşleşme arenasındaki bileşenlerin manipüle edilmesi, bir bileşiğin varlığını saptamak için değerli olabilir. Bu tahlil, diğer erkek ve dişi üreme davranışlarının yanı sıra, çiftleşme davranışına ve doğurganlığa genetik ve çevresel ipuçlarının etkisi hakkında sorulara cevap verecek şekilde uyarlanabilir.

Introduction

Üreme davranışları, özellikle erkeklerinkinden daha büyük gametler üreten ve gelişmekte olan yavrularını yükseltmek için koşulları özenle seçmek zorunda kalan dişiler için, genellikle yüksek enerji maliyetlerine sahiptir. Enerji maliyeti nedeniyle, üremenin beslenme koşullarıyla bağlantılı olması şaşırtıcı değildir. Yetişkin beslenme nedeniyle ergenliği ertelenebilen memeliler de dahil olmak üzere hayvanlara rağmen hepsi olmasa da çoğu geçerlidir ve cinsel yönelimleri gıda kısıtlamasından olumsuz yönde etkilenebilir 1 .

Genetik model organizmanın çoğalması Drosophila melanogaster de beslenme koşullarından etkilenir. Gıda uçucuların 2 varlığında yüksek düzeyde Erkekler kortu ve dişiler daha cinsel maya, yumurta üretimi ve yavru hayatta kalma 3, 4, 5 için önemli bir besin varlığında kabul vardır. BuEvrimsel olarak korunan gıda üreme tepkisi, çevresel gıda bulunabilirliğini cinsel üremeye bağlayan mekanizmaları genetik bakımdan ve zamandan tasarruf sağlayan bir organizmada inceleme fırsatı sunar. Gerçekten de, D. melanogaster'taki çalışma insülin yolağını gıda ile çiftleşme ilişkisi arasındaki bağlantının önemli bir regülatörü olarak ortaya koymuştur 6 . Aynı zamanda, çiftleşme hareketi, kadınların gıda tercihlerini ve ayrıca ilişkili kemorensör nöronları 7 , 8 , 9'u değiştirdiğini göstermiştir .

Yemek ipuçlarının D. melanogasterin üreme davranışlarını etkilediği açıktır. Bu etkiler ağırlıklı olarak kadınları, özellikle de 5'i çiftleşmiş olanları etkilemektedir. Bununla birlikte, çevresel koşulların bu akut etkilerini test etmek için, kadın çiftleşme davranışına klasik olarak kullanılan tahlilEşleşen bölümler arasındaki uzun kesintiler nedeniyle çok uygun olmazlar. Klasik iyileştirme tahlilinde bakire bir kadın ilk önce bir erkekle çiftleşir ve hemen izole edilir ve 24 ila 48 saat sonra yeni bir erkekle birlikte sunulur. Bu klasik tahlil, erkek ejakülatının bayan davranışını ve bayan tepkisini değiştiren bileşenleri tanımlamak için büyük başarı elde etti 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Bu nedenle, burada gösterilen sürekli çiftleşme deneyi, üreme davranışları üzerindeki çevresel koşulların akut etkisini incelemek için kullanılabilen klasik çiftleşme deneylerine ektir.

Burada açıklanan çiftleşme davranışı için sürekli tahlil kullanarak, daha önce mayaya maruz kalan bir çift sinekin s24 saatlik bir gözlem süresi 5, 19, 20, 21 üzerinde everal kez, sinekler sadece olacak Remate kez yemek 5 maruz değil ise. Bu bulgu, D. melanogaster literatürünün büyük bir bölümünün ışığında şaşkın olabilir ki, dişilerin ilk çiftleşmeden birkaç gün sonra telafi edilmediğini gösterir (referanslar 10 , 11'de gözden geçirilmiştir ). Bununla birlikte, bu tutarsızlık, yeni bir çiftleşme fırsatı sağlanmadan önce bir ila birkaç gün arasında bir kadının izole edildiği tahlil koşulları ile kolaylıkla açıklanabilir. Eğer bu saatlik gözlem döneminde çift eşleşmezse, kadın kabul edilemez olarak nitelendirilir. Dahası, yüksek çiftleşme sıklığı, yabani yakalanan sineklerin verdikleri verilerin, depolama organlarında 4-6 erkek arasında sperm bulunduğuna göre şaşırtıcı olmamalıdır; Böylece içindeBu dişilerin doğal olarak birkaç kez telafi edildiğini söyleyerek 22 , 23 .

Burada, çiftleşmenin frekansını modüle etmek için sineklerin çevresel koşullar hakkında nasıl bilgi toplayıp bir araya getirdiklerini ortaya çıkarmak için bu sürekli çiftleşme denemesinin kullanımını kanıtlıyoruz. Bu test, genetik çalışmalar için nispeten çok çift çiftin test edilmesini ve uçucu ve uçucu olmayan çevresel ipuçlarının etkisini sınamanızı sağlar. Deney, tipik olarak 24 saat sürer ancak açık-koyu (LD) döngü gibi bisiklet ortamı ipuçlarının test edilmesine olanak tanıyan 48 saate kadar uzatılabilir. Bu tahlil, bir gıda sanayiinde uçucu olmayan maya besin maddesinin mevcudiyeti ile birlikte bir basınçlı hava sistemi içindeki bir maya kültürünün uçucu ipuçlarının etkisini test ederek göstermektedir.

Basınçlı hava sistemi sürekli olarak uçucu ipuçlarını birbirine giren bir arenaya pompalarBir gıda substratı ve bir test çifti (çiftleşme davranışı izlenir). Mayaların etkileşime giren özelliklerini daha ayrıntılı olarak belirlemek için, gıda substratındaki mayaya tekabül eden bir amino asit içeriği ile bir arada, önemli bir uçucu maya bileşikini, yani asetik asit 24'ü , pepton (amino Hayvansal proteinlerin enzimatik sindiriminden elde edilen asitler). Bu deneyler birlikte, D. melanogaster'ın çiftleşme davranışı üzerindeki çevresel ipuçlarının etkisinin bu tahlil ile nasıl test edilebileceğini gösterir.

Protocol

1. Çevresel Kontrollü Eşleştirme Kutusu Kontrollü ve kolay temizlenebilen bir test alanı sağlamak için, Şekil 1A'da gösterildiği gibi 120 cm x 64 cm x 85 cm paslanmaz çelik mutfak dolabını kurun. Tavanın hemen altındaki dolabın arkasına bir delik açın ve her biri 2 cm çapında dört yuva dört delik açın. Kutunun altından 7 cm, delikler arasında 12.5 cm yükseklikte kutunun her iki tarafındaki dört delikten oluşan ilk iki kümeyi delin. Kutunun her iki…

Representative Results

Bu devamlı testi, çiftleşme davranışını ve çiftleşme frekansını spesifik olarak kullanarak, deneysel çevre koşulları altında belirlenebilir. Çevresel koşulları kontrol altında tutmak için, paslanmaz çelik bir mutfak dolabını, kendi ışık kaynağıyla ve difüzyonuyla, yüksek bir bolluk ışığı ve eşleşme arenalarından en az miktarda parıltı sağlayan bir test alanı haline getirdik ( Şekil 1A ) . İç test alanı, hekzan veya etanol gib…

Discussion

Bu protokol, çiftleşme çiftinin çiftleşme frekansını belirlemek için kullanıldığı varsayılan çevresel ipuçlarını sürekli kontrol ederken, çiftleşme davranışını 24 saat boyunca test eden bir testi açıklamaktadır. Ortam mayayı da içerdiğinde basınçlı bir hava sistemi vasıtasıyla sağlanan maya havasına yanıt olarak çiftleşme frekansını arttırmak mümkündür ( Şekil 2B ). Ek olarak, çiftleşme frekansında benzer bir tepki, ortamda doğrudan agar, pepton ve aset…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Sinek stokları için Bloomington Drosophila Stok Merkezi'ne teşekkür ediyoruz; C. Gahr, JT Alkema ve S. van Hasselt, basınçlı hava testini geliştirme konusundaki ilk girişimlerinden; Maya yetiştirme tavsiyesi için Jasper Bosman; Ve Rezza Azanchi ve Joel Levine, orijinal olarak Drosophila çiftleşme davranışının zaman aşımı izlemesini geliştirdiler. JA Gorter bir Neuroscience Araştırma Okulu BCN / NWO Lisansüstü Programı hibe tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, kısmen Hollandalı bilimsel araştırma organizasyonu (NWO) (referans: 821.02.020) tarafından JC Billeter tarafından desteklendi.

Materials

Cabinet
Stainless steel kitchen cabinet Horecaworld 7412.0105
White LEDs Lucky Light ll-583wc2c-001 Cold white, 20 mAmp and 2 V
Red LEDs Lucky Ligt ll-583vc2c-v1-4da Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Resistor Royal Ohm CFR0W4J0561A50 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance
Smartphone light meter app Patrick Giudicelli Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1
Power timer Alecto TS-121
Metal brackets Sharp angle 5 by 5 mm,  2 x 5450 and 1 x 1100 mm long
Frosted glass plate 1190 x 545 x 5 mm
Filter paper sheets LEE filters 220 White frost
Small fan Nanoxia Deep silence 4260285292828 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM
Big fan Nanoxia Deep silence 4260285292910 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM
Webcam camera Logitech 950270 B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel  
Camera software DeskShare Security monitor pro
Name Company Catalog Number Comments
Fly rearing
Fly rearing bottles Flystuff 32-130 6oz Drosophila stock bottle
Flypad Flystuff 59-114
Wild-type flies Canton-S
Fly rearing vials Dominique Dutscher 789008 Drosophila tubes narrow 25×95 mm
Incubator Sanyo MIR-154
Magnetic hot plate Heidolph 505-20000-00 MR Hei-Standard
Agar Caldic Ingredients B.V. 010001.26.0
Glucose Gezond&wel 1019155 Dextrose/Druivensuiker
Sucrose Van Gilse Granulated sugar
Cornmeal Flystuff 62-100
Wheat germ Gezond&wel 1017683
Soy flour Flystuff 62-115
Molasses Flystuff 62-117
Active dry yeast Red Star
Tegosept Flystuff 20-258 100%
Peptone (bacto) BD 211677
Acetic Acid Merck 1000631000 Glacial, 100%
Small petridish Greiner bio-one 627102 35 x 10 mm with vents
Paraffin film Bemis NA Parafilm
Name Company Catalog Number Comments
Yeast and pressurised air set-up
Big petridish Gosselin BP140-01 140 x 20.6 mm
Ultrapure water Millipore corporation MiliQ
Yeast extract BD 212750
Agar (pure) BD 214530 bacto
Glucose (0(+)-glucose monohydrate)  Merck 18270000004
Open caps Schott 29 240 28  GL45
Silicone septum VWR 548-0662
Barbed bulkhead fittings Nalgene 6149-0002
Large PVC tubing diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm
Small PVC tubing diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm
15 ml tube Falcon
Aquarium pump Sera precision Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar
Activated charcoal Superfish A8040400 Norit activated carbon
Disposible filter unit Whatman 10462100
Serological pipettes VWR 612-1600
Syringe BD Plastipak 300013
Hot glue Pattex
Syringe filter Whatman FP 30/pore size 0.45 mm CA-S
Name Company Catalog Number Comments
Analysis
Statistics software R lme4 package

Referências

  1. Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
  2. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
  3. Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
  4. Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
  5. Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -. C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
  6. Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
  7. Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
  8. Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
  9. Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
  10. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
  11. Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, 1-108 (2014).
  12. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  13. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
  14. Yapici, N., Kim, Y. -. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
  15. Yang, C. -. H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
  16. Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
  17. Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -. B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
  18. Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
  19. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
  20. Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
  21. Krupp, J. J., Billeter, J. -. C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
  22. Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
  23. Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
  24. Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
  25. Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
  26. Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575 (2011).
  27. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
  28. Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
  29. Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
  30. Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).
check_url/pt/55690?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Gorter, J. A., Billeter, J. A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (125), e55690, doi:10.3791/55690 (2017).

View Video