Summary

En metode for å teste effekten av miljøvennlige påkjenningshendelser i<em> Drosophila melanogaster</em

Published: July 17, 2017
doi:

Summary

Vi demonstrerer en analyse for å analysere de miljømessige og genetiske signaler som påvirker parringsadferd i fruktflugten Drosophila melanogaster .

Abstract

En persons seksuelle kjøring påvirkes av genotype, erfaring og miljøforhold. Hvordan disse faktorene samhandler for å modulere seksuell oppførsel forblir dårlig forstått. I Drosophila melanogaster påvirker miljømessige signaler, for eksempel mattilgjengelighet, parring, som tilbyr et tett system for å undersøke mekanismene som modulerer seksuell oppførsel. I D. melanogaster blir miljøsignaler ofte registrert via kjemosensoriske gustatory og olfactory systemer. Her presenterer vi en metode for å teste effekten av miljømessige kjemiske tegn på parringsadferd. Analysen består av en liten parringsarena som inneholder matmedium og parringspar. Parringsfrekvensen for hvert par overvåkes kontinuerlig i 24 timer. Her presenterer vi anvendeligheten av denne analysen for å teste miljøforbindelser fra en ekstern kilde gjennom et trykkluftsystem, samt manipulering av miljøkomponentene direkte i parringsarenaen. Den uSe et trykkluftsystem er spesielt nyttig for å teste effekten av svært flyktige forbindelser, mens manipulering av komponenter direkte i parringsarenaen kan være av betydning for å fastslå en forbindelses nærvær. Denne analysen kan tilpasses for å svare på spørsmål om påvirkning av genetiske og miljømessige tegn på parringsadferd og fecundity samt andre reproduksjonsegenskaper hos mann og kvinne.

Introduction

Reproduktiv oppførsel har vanligvis høye energikostnader, spesielt for kvinner, som produserer større gameter enn menn, og må nøye velge forholdene for å øke deres utviklingsavkom. På grunn av energikostnaden er det ikke overraskende at gjengivelse er knyttet til ernæringsmessige forhold. Dette gjelder i de fleste, om ikke alle, dyr, inkludert pattedyr, hvis pubertet kan forsinkes av underernæring, og hvis seksuell kjøring kan bli negativt påvirket av matbegrensning 1 .

Reproduksjonen av den genetiske modellorganismen Drosophila melanogaster påvirkes også av næringsbetingelsene. Males domstol på høyere nivå i nærvær av matvarer 2 , og kvinner er mer seksuelt mottakelige i nærvær av gjær, et viktig næringsstoff for eggproduksjon og avkom overlevelse 3 , 4 , 5 . DetteEvolusjonær konservert reproduktiv respons på mat gir mulighet til å studere mekanismer som forbinder miljøtilgjengelig mat til seksuell reproduksjon i en genetisk trakettbar og tidseffektiv organisme. Faktisk har arbeidet i D. melanogaster implisert insulinveien som en viktig regulator for sammenhengen mellom mat og parringsadferd 6 . Det har også vist at handlingen med parring selv forandrer matenes preferanse hos kvinner samt de tilhørende kjemosensoriske nevronene 7 , 8 , 9 .

Det er tydelig at matinnretninger påvirker reproduksjonsegenskaper i D. melanogaster . Disse effektene synes hovedsakelig å påvirke kvinner, spesielt de som allerede har parret 5 . Imidlertid, for å teste disse akutte effektene av miljøforholdene, kan analysen som er klassisk brukt for kvinnelig parringsadferdIkke være veldig egnet på grunn av lange avbrudd mellom parringsepisoder. I den klassiske remieringsanalysen mates en jomfru kvinne først med en mann, og blir umiddelbart isolert og presentert med en ny mann 24 til 48 timer senere. Denne klassiske analysen har blitt brukt med stor suksess for å identifisere komponenter av mannlig ejakulat som endrer kvinnelig oppførsel og kvinnelig respons 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Den kontinuerlige parringsanalysen som er vist her, er derfor et tillegg til klassiske parringsanalyser som kan brukes til å studere den akutte effekten av miljøforholdene på reproduksjonsadferd.

Ved hjelp av den kontinuerlige analysen for parringsadferd som forklares her, viste vi tidligere at et par fluer utsatt for gjær vil remate sEveral ganger over en 24 timers observasjonsperiode 5 , 19 , 20 , 21 , mens fluer ikke utsettes for mat, vil det bare bli remittert en gang til 5 . Dette funnet kan være lurende i lys av en stor del av D. melanogaster litteraturen som indikerer at kvinner ikke remitterer i flere dager etter en første parring (omtalt i referanser 10 , 11 ). Denne forskjellen kan imidlertid lett forklares ved analysevilkår, hvor en kvinne er isolert i en til flere dager før en ny parringsmulighet er gitt. Hvis paret ikke møtes i denne times lange observasjonsperioden, er kvinnen karakterisert som ikke mottakelig. Videre bør den høye parringsfrekvensen ikke være overraskende gitt at dataene fra villfangte fluer viser at kvinner inneholder sæd fra 4 til 6 menn i deres lagringsorganer; Dermed iDicatere at kvinner avhenger naturlig flere ganger 22 , 23 .

Her demonstrerer vi bruken av denne kontinuerlige parringsanalysen for å løse hvordan fluene samler og kombinerer informasjon om miljøforhold for å modulere parringsfrekvens. Denne analysen tillater en å teste et relativt stort antall parringpar for genetiske studier og for å teste innflytelsen fra flyktige og ikke-flyktige miljøvennlige tegn. Assayet kjører typisk i 24 timer, men kan forlenges til 48 timer, slik at testingen av syklusmiljøkilder, som lys-mørke (LD) syklusen. Vi demonstrerer denne analysen ved å teste innflytelsen fra flyktige signaler fra en gjærkultur i et trykkluftsystem i kombinasjon med tilgjengeligheten av ikke-flyktig gjærnæringsstoff i mattsubstratet.

Trykkluftsystemet pumper kontinuerlig flyktige signaler inn i en paringsarena som inneholderEt mattsubstrat og et testpar (hvis parringsadferd blir overvåket). For å ytterligere bestemme de spesifikke som gjær påvirker parring, tester vi en stor, flyktig forbindelse av gjær, nemlig eddiksyre 24 , i kombinasjon med et aminosyreinnhold som tilsvarer gjærens i mattsubstratet, i form av pepton (amino Syrer utledet fra enzymatisk fordøyelse av animalske proteiner). Sammen viser disse forsøkene hvordan effekten av miljøsignaler på dermatopførelsen av D. melanogaster kan testes med denne analysen.

Protocol

1. Miljøstyrt paringsboks For å sikre et kontrollert og lett å rengjøre testområdet, sett opp et kjøkkenskap av rustfritt stål på 120 cm x 64 cm x 85 cm som vist på figur 1A. Bor et hull på baksiden av skapet like under taket og fire sett med fire hull i sidene, hver med en diameter på 2 cm. Bor de to første settene med fire hull, på hver side av esken i en høyde på 7 cm fra bunnen av esken og med 12,5 cm mellom hullene. Bor de to andre settene på hver side av boksen …

Representative Results

Ved bruk av denne kontinuerlige analysen, parringsadferd og parringsfrekvensen i spesifikk, kan bestemmes under eksperimentelle miljøforhold. For å kontrollere miljøforholdene forvandlet vi et kjøkkenskap i rustfritt stål til et testområde med egen lyskilde og diffusjon, noe som sikrer en høy overflod av lys og en minimal glans fra toppen av parringsarenaene ( Figur 1A ) . Det indre testområdet er helt innkapslet av rustfritt stål og glass, noe som gjør det mul…

Discussion

Denne protokollen beskriver en test for å teste parringsadferd i løpet av 24 timer, mens du kontinuerlig kontrollerer de miljømessige tegnene som et parringpar er hypotetisert til å bestemme parringsfrekvensen. Det er mulig å øke parringsfrekvensen som svar på gjærluft levert gjennom et trykkluftsystem når mediet inneholder gjær også ( figur 2B ). I tillegg kan en lignende respons i parringsfrekvens observert med et forenklet matmedium som bare inneholder agar-, pepton- og eddiksyre lukt dire…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Bloomington Drosophila Stock Center for flybestandene; C. Gahr, JT Alkema og S. van Hasselt for deres tidlige forsøk på å utvikle trykkluftanalysen; Jasper Bosman for råd om dyrking av gjær; Og Rezza Azanchi og Joel Levine for å opprinnelig utvikle tidsavbruddskontrollen av Drosophila parringsadferd. JA Gorter ble støttet av et stipendiat for stipendiat fra Neuroscience Research School BCN / NWO. Dette arbeidet ble delvis støttet av den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO) (referanse: 821.02.020) til JC Billeter.

Materials

Cabinet
Stainless steel kitchen cabinet Horecaworld 7412.0105
White LEDs Lucky Light ll-583wc2c-001 Cold white, 20 mAmp and 2 V
Red LEDs Lucky Ligt ll-583vc2c-v1-4da Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V
Resistor Royal Ohm CFR0W4J0561A50 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance
Smartphone light meter app Patrick Giudicelli Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1
Power timer Alecto TS-121
Metal brackets Sharp angle 5 by 5 mm,  2 x 5450 and 1 x 1100 mm long
Frosted glass plate 1190 x 545 x 5 mm
Filter paper sheets LEE filters 220 White frost
Small fan Nanoxia Deep silence 4260285292828 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM
Big fan Nanoxia Deep silence 4260285292910 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM
Webcam camera Logitech 950270 B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel  
Camera software DeskShare Security monitor pro
Name Company Catalog Number Comments
Fly rearing
Fly rearing bottles Flystuff 32-130 6oz Drosophila stock bottle
Flypad Flystuff 59-114
Wild-type flies Canton-S
Fly rearing vials Dominique Dutscher 789008 Drosophila tubes narrow 25×95 mm
Incubator Sanyo MIR-154
Magnetic hot plate Heidolph 505-20000-00 MR Hei-Standard
Agar Caldic Ingredients B.V. 010001.26.0
Glucose Gezond&wel 1019155 Dextrose/Druivensuiker
Sucrose Van Gilse Granulated sugar
Cornmeal Flystuff 62-100
Wheat germ Gezond&wel 1017683
Soy flour Flystuff 62-115
Molasses Flystuff 62-117
Active dry yeast Red Star
Tegosept Flystuff 20-258 100%
Peptone (bacto) BD 211677
Acetic Acid Merck 1000631000 Glacial, 100%
Small petridish Greiner bio-one 627102 35 x 10 mm with vents
Paraffin film Bemis NA Parafilm
Name Company Catalog Number Comments
Yeast and pressurised air set-up
Big petridish Gosselin BP140-01 140 x 20.6 mm
Ultrapure water Millipore corporation MiliQ
Yeast extract BD 212750
Agar (pure) BD 214530 bacto
Glucose (0(+)-glucose monohydrate)  Merck 18270000004
Open caps Schott 29 240 28  GL45
Silicone septum VWR 548-0662
Barbed bulkhead fittings Nalgene 6149-0002
Large PVC tubing diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm
Small PVC tubing diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm
15 ml tube Falcon
Aquarium pump Sera precision Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar
Activated charcoal Superfish A8040400 Norit activated carbon
Disposible filter unit Whatman 10462100
Serological pipettes VWR 612-1600
Syringe BD Plastipak 300013
Hot glue Pattex
Syringe filter Whatman FP 30/pore size 0.45 mm CA-S
Name Company Catalog Number Comments
Analysis
Statistics software R lme4 package

Referências

  1. Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
  2. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
  3. Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
  4. Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
  5. Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -. C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
  6. Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
  7. Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
  8. Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
  9. Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
  10. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
  11. Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, 1-108 (2014).
  12. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  13. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
  14. Yapici, N., Kim, Y. -. J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
  15. Yang, C. -. H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
  16. Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
  17. Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -. B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
  18. Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
  19. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
  20. Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
  21. Krupp, J. J., Billeter, J. -. C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
  22. Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
  23. Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
  24. Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
  25. Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
  26. Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575 (2011).
  27. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
  28. Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
  29. Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
  30. Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).
check_url/pt/55690?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Gorter, J. A., Billeter, J. A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (125), e55690, doi:10.3791/55690 (2017).

View Video