Vi demonstrerer en analyse for å analysere de miljømessige og genetiske signaler som påvirker parringsadferd i fruktflugten Drosophila melanogaster .
En persons seksuelle kjøring påvirkes av genotype, erfaring og miljøforhold. Hvordan disse faktorene samhandler for å modulere seksuell oppførsel forblir dårlig forstått. I Drosophila melanogaster påvirker miljømessige signaler, for eksempel mattilgjengelighet, parring, som tilbyr et tett system for å undersøke mekanismene som modulerer seksuell oppførsel. I D. melanogaster blir miljøsignaler ofte registrert via kjemosensoriske gustatory og olfactory systemer. Her presenterer vi en metode for å teste effekten av miljømessige kjemiske tegn på parringsadferd. Analysen består av en liten parringsarena som inneholder matmedium og parringspar. Parringsfrekvensen for hvert par overvåkes kontinuerlig i 24 timer. Her presenterer vi anvendeligheten av denne analysen for å teste miljøforbindelser fra en ekstern kilde gjennom et trykkluftsystem, samt manipulering av miljøkomponentene direkte i parringsarenaen. Den uSe et trykkluftsystem er spesielt nyttig for å teste effekten av svært flyktige forbindelser, mens manipulering av komponenter direkte i parringsarenaen kan være av betydning for å fastslå en forbindelses nærvær. Denne analysen kan tilpasses for å svare på spørsmål om påvirkning av genetiske og miljømessige tegn på parringsadferd og fecundity samt andre reproduksjonsegenskaper hos mann og kvinne.
Reproduktiv oppførsel har vanligvis høye energikostnader, spesielt for kvinner, som produserer større gameter enn menn, og må nøye velge forholdene for å øke deres utviklingsavkom. På grunn av energikostnaden er det ikke overraskende at gjengivelse er knyttet til ernæringsmessige forhold. Dette gjelder i de fleste, om ikke alle, dyr, inkludert pattedyr, hvis pubertet kan forsinkes av underernæring, og hvis seksuell kjøring kan bli negativt påvirket av matbegrensning 1 .
Reproduksjonen av den genetiske modellorganismen Drosophila melanogaster påvirkes også av næringsbetingelsene. Males domstol på høyere nivå i nærvær av matvarer 2 , og kvinner er mer seksuelt mottakelige i nærvær av gjær, et viktig næringsstoff for eggproduksjon og avkom overlevelse 3 , 4 , 5 . DetteEvolusjonær konservert reproduktiv respons på mat gir mulighet til å studere mekanismer som forbinder miljøtilgjengelig mat til seksuell reproduksjon i en genetisk trakettbar og tidseffektiv organisme. Faktisk har arbeidet i D. melanogaster implisert insulinveien som en viktig regulator for sammenhengen mellom mat og parringsadferd 6 . Det har også vist at handlingen med parring selv forandrer matenes preferanse hos kvinner samt de tilhørende kjemosensoriske nevronene 7 , 8 , 9 .
Det er tydelig at matinnretninger påvirker reproduksjonsegenskaper i D. melanogaster . Disse effektene synes hovedsakelig å påvirke kvinner, spesielt de som allerede har parret 5 . Imidlertid, for å teste disse akutte effektene av miljøforholdene, kan analysen som er klassisk brukt for kvinnelig parringsadferdIkke være veldig egnet på grunn av lange avbrudd mellom parringsepisoder. I den klassiske remieringsanalysen mates en jomfru kvinne først med en mann, og blir umiddelbart isolert og presentert med en ny mann 24 til 48 timer senere. Denne klassiske analysen har blitt brukt med stor suksess for å identifisere komponenter av mannlig ejakulat som endrer kvinnelig oppførsel og kvinnelig respons 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Den kontinuerlige parringsanalysen som er vist her, er derfor et tillegg til klassiske parringsanalyser som kan brukes til å studere den akutte effekten av miljøforholdene på reproduksjonsadferd.
Ved hjelp av den kontinuerlige analysen for parringsadferd som forklares her, viste vi tidligere at et par fluer utsatt for gjær vil remate sEveral ganger over en 24 timers observasjonsperiode 5 , 19 , 20 , 21 , mens fluer ikke utsettes for mat, vil det bare bli remittert en gang til 5 . Dette funnet kan være lurende i lys av en stor del av D. melanogaster litteraturen som indikerer at kvinner ikke remitterer i flere dager etter en første parring (omtalt i referanser 10 , 11 ). Denne forskjellen kan imidlertid lett forklares ved analysevilkår, hvor en kvinne er isolert i en til flere dager før en ny parringsmulighet er gitt. Hvis paret ikke møtes i denne times lange observasjonsperioden, er kvinnen karakterisert som ikke mottakelig. Videre bør den høye parringsfrekvensen ikke være overraskende gitt at dataene fra villfangte fluer viser at kvinner inneholder sæd fra 4 til 6 menn i deres lagringsorganer; Dermed iDicatere at kvinner avhenger naturlig flere ganger 22 , 23 .
Her demonstrerer vi bruken av denne kontinuerlige parringsanalysen for å løse hvordan fluene samler og kombinerer informasjon om miljøforhold for å modulere parringsfrekvens. Denne analysen tillater en å teste et relativt stort antall parringpar for genetiske studier og for å teste innflytelsen fra flyktige og ikke-flyktige miljøvennlige tegn. Assayet kjører typisk i 24 timer, men kan forlenges til 48 timer, slik at testingen av syklusmiljøkilder, som lys-mørke (LD) syklusen. Vi demonstrerer denne analysen ved å teste innflytelsen fra flyktige signaler fra en gjærkultur i et trykkluftsystem i kombinasjon med tilgjengeligheten av ikke-flyktig gjærnæringsstoff i mattsubstratet.
Trykkluftsystemet pumper kontinuerlig flyktige signaler inn i en paringsarena som inneholderEt mattsubstrat og et testpar (hvis parringsadferd blir overvåket). For å ytterligere bestemme de spesifikke som gjær påvirker parring, tester vi en stor, flyktig forbindelse av gjær, nemlig eddiksyre 24 , i kombinasjon med et aminosyreinnhold som tilsvarer gjærens i mattsubstratet, i form av pepton (amino Syrer utledet fra enzymatisk fordøyelse av animalske proteiner). Sammen viser disse forsøkene hvordan effekten av miljøsignaler på dermatopførelsen av D. melanogaster kan testes med denne analysen.
Denne protokollen beskriver en test for å teste parringsadferd i løpet av 24 timer, mens du kontinuerlig kontrollerer de miljømessige tegnene som et parringpar er hypotetisert til å bestemme parringsfrekvensen. Det er mulig å øke parringsfrekvensen som svar på gjærluft levert gjennom et trykkluftsystem når mediet inneholder gjær også ( figur 2B ). I tillegg kan en lignende respons i parringsfrekvens observert med et forenklet matmedium som bare inneholder agar-, pepton- og eddiksyre lukt dire…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Bloomington Drosophila Stock Center for flybestandene; C. Gahr, JT Alkema og S. van Hasselt for deres tidlige forsøk på å utvikle trykkluftanalysen; Jasper Bosman for råd om dyrking av gjær; Og Rezza Azanchi og Joel Levine for å opprinnelig utvikle tidsavbruddskontrollen av Drosophila parringsadferd. JA Gorter ble støttet av et stipendiat for stipendiat fra Neuroscience Research School BCN / NWO. Dette arbeidet ble delvis støttet av den nederlandske organisasjonen for vitenskapelig forskning (NWO) (referanse: 821.02.020) til JC Billeter.
Cabinet | |||
Stainless steel kitchen cabinet | Horecaworld | 7412.0105 | |
White LEDs | Lucky Light | ll-583wc2c-001 | Cold white, 20 mAmp and 2 V |
Red LEDs | Lucky Ligt | ll-583vc2c-v1-4da | Wavelength between 625 nm, 20 mAmp and 6 V |
Resistor | Royal Ohm | CFR0W4J0561A50 | 560 ohm, 0.25 W, 250 V and 5 % tolerance |
Smartphone light meter app | Patrick Giudicelli | Light/Lux Meter FREE, version 1.1.1 | |
Power timer | Alecto | TS-121 | |
Metal brackets | Sharp angle 5 by 5 mm, 2 x 5450 and 1 x 1100 mm long | ||
Frosted glass plate | 1190 x 545 x 5 mm | ||
Filter paper sheets | LEE filters | 220 | White frost |
Small fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292828 | 80 mm Ultra-Quiet PC Fan, 1200 RPM |
Big fan | Nanoxia Deep silence | 4260285292910 | 120 mm Ultra-Quiet PC Fan, 650-1500 RPM |
Webcam camera | Logitech | 950270 | B910 HD WEBCAM OEM, Angle: 78-degree, resolution: 5-million-pixel |
Camera software | DeskShare | Security monitor pro | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fly rearing | |||
Fly rearing bottles | Flystuff | 32-130 | 6oz Drosophila stock bottle |
Flypad | Flystuff | 59-114 | |
Wild-type flies | Canton-S | ||
Fly rearing vials | Dominique Dutscher | 789008 | Drosophila tubes narrow 25×95 mm |
Incubator | Sanyo | MIR-154 | |
Magnetic hot plate | Heidolph | 505-20000-00 | MR Hei-Standard |
Agar | Caldic Ingredients B.V. | 010001.26.0 | |
Glucose | Gezond&wel | 1019155 | Dextrose/Druivensuiker |
Sucrose | Van Gilse | Granulated sugar | |
Cornmeal | Flystuff | 62-100 | |
Wheat germ | Gezond&wel | 1017683 | |
Soy flour | Flystuff | 62-115 | |
Molasses | Flystuff | 62-117 | |
Active dry yeast | Red Star | ||
Tegosept | Flystuff | 20-258 | 100% |
Peptone (bacto) | BD | 211677 | |
Acetic Acid | Merck | 1000631000 | Glacial, 100% |
Small petridish | Greiner bio-one | 627102 | 35 x 10 mm with vents |
Paraffin film | Bemis NA | Parafilm | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Yeast and pressurised air set-up | |||
Big petridish | Gosselin | BP140-01 | 140 x 20.6 mm |
Ultrapure water | Millipore corporation | MiliQ | |
Yeast extract | BD | 212750 | |
Agar (pure) | BD | 214530 | bacto |
Glucose (0(+)-glucose monohydrate) | Merck | 18270000004 | |
Open caps | Schott | 29 240 28 | GL45 |
Silicone septum | VWR | 548-0662 | |
Barbed bulkhead fittings | Nalgene | 6149-0002 | |
Large PVC tubing | diameter: outer 1.2 cm and inner 0.9 cm | ||
Small PVC tubing | diameters: outer 0.8 cm and inner 0.5 cm | ||
15 ml tube | Falcon | ||
Aquarium pump | Sera precision | Sera air 110 plus, AC 220-240 V, 50/60 Hz, 3 W and pressure >100 mbar | |
Activated charcoal | Superfish | A8040400 | Norit activated carbon |
Disposible filter unit | Whatman | 10462100 | |
Serological pipettes | VWR | 612-1600 | |
Syringe | BD Plastipak | 300013 | |
Hot glue | Pattex | ||
Syringe filter | Whatman | FP 30/pore size 0.45 mm CA-S | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Analysis | |||
Statistics software | R | lme4 package |