Phenotypic Analisi del roditore Malaria Parassita Sessuale e Sessuale Fasi Sangue e Mosquito Fasi

I parassiti della malaria causano centinaia di milioni di infezioni da malaria nell’uomo in tutto il mondo, con più di 600.000 decessi ogni anno¹. Le infezioni umane sono causate da cinque specie parassitarie della malaria, vale a dire P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariaee P. knowlesi. La maggior parte delle decessi cliniche per la malaria sono causate da P. falciparum nell’Africa sub-sahariana¹. Un’altra specie di parassita della malaria umana che causa ampie morbilità in tutto il mondo al di fuori dell’Africa subsahariana è P. vivax². Le altre tre specie sono tutte più geograficamente limitate e causano infezioni benigne della malaria, ad eccezione del letale P. knowlesi³. L’indisponibilità di modelli in vivo rilevanti e pratici non umani delle infezioni è sempre stata ed è ancora un ostacolo al vaccino antimalarico e allo sviluppo di farmaci. Precedente al targeting del farmaco antimalarico e studi metabolici hanno fatto ampio affidamento su modelli di malaria aviaria come P. gallinaceum e P. lophurae, infettando polli e anatre, rispettivamente⁴. Successivamente, le specie di malaria dei roditori sono state gradualmente introdotte in vari vaccini e studi di targeting farmacologico come modelli in vivo. Nel corso degli anni, si sono accumulate prove di somiglianze della biologia e delle interazioni ospite-parassita delle fasi del ciclo di vita dei modelli di malaria dei roditori con le specie della malaria umana.

In particolare, i modelli di malaria dei roditori erano estremamente importanti per esplorare e caratterizzare la biologia delle zanzare e degli stadi pre-errocitici⁵. Tuttavia, ci sono quattro specie di malaria roditore (P. berghei, P. yoelii, P. chabaudi, e P. vinckei) che hanno diverse caratteristiche biologiche, il più notevole dei quali sono negli stadi del sangue⁶. Le specie di malaria del roditore differiscono nella sincronia delle stadi ematici, dove le stadi ematiche dei ceppi P. chabaudi e P. vinckei sono per lo più sincrone, mentre le fasi del sangue di P. berghei e P. yoelii non sono^{6 , 7}. Un’altra differenza notevole è l’auto-eliminazionedelle stadi del sangue che si verifica in alcuni ceppi (ad esempio, P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65 e P. vinckei lentum),mentre l’infezione del sangue di altri ceppi della stessa specie potrebbero essere letali se non trattati (P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA, e P. chabaudi AS). Inoltre, p. yoelii 17X-NL ceppo e P. berghei ANKA ceppo preferibilmente invadere i reticulocyti^8,9,10,11, anche se queste caratteristiche di P. I ceppi di yoelii e P. berghei non sono un rigoroso requisito di crescita^12,13,14. Pertanto, i topi vengono trattati con feniliddrzina prima di un’infezione con gli stadi del sangue di tali parassiti per aumentare la parasitemia e la gametocitemia necessari per un’infezione da zanzara per il ceppo P. berghei ANKA e per P. yoelii 17X-NL^{15,16,17,18,19}.

Differenze nello sviluppo delle stadi di zanzara esistono anche tra le diverse specie di malaria roditore, la più notevole è la temperatura e il tempo necessari per lo sviluppo ottimale delle stadi di zanzara e la lunghezza sporozoite^{5,6, 20}. Negli stadi pre-erritrociti delle specie di malaria roditore, le differenze includono le specie di roditori e i ceppi più suscettibili all’inoculazione infettiva della sporozoite, il numero di sporozoiti necessari per l’inoculazione in un ceppo di roditori suscettibili, tipi di cellule mammiferi necessari per i saggi di sviluppo in fase epatica in vitro, e il tempo per completare lo sviluppo dello stadio epatico^{5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30}.

Nonostante queste variabilità, i parassiti della malaria dei roditori erano i modelli favorevoli fin dall’inizio per l’applicazione di approcci genetici inversi, perché erano meno dispendiosi di tempo e risorse con un’alta probabilità di successo³¹. Infatti, i modelli di malaria dei roditori sono stati i modelli migliori, e in molti casi gli unici modelli, disponibili per numerosi anni per caratterizzare funzionalmente i geni espressi negli stadi di zanzare e fegato.

Alla luce della popolarità e dell’amenabilità degli approcci genetici inversi nei modelli di malaria dei roditori, sono state utilizzate diverse metodologie per analizzare i fenotipi delle fasi del ciclo di vita dei parassiti transgenici, in particolare le fasi del sangue. Tuttavia, alcune di queste metodologie sono incoerenti; per esempio, confrontando le infezioni di parassiti in fase sanguigna dopo un’iniezione di IP (che sono probabilmente drenati ai linfonodi peritoneali e, da lì, possono entrare nel flusso sanguigno; quindi, i parassiti iniettati non finiscono ugualmente nel flusso sanguigno) , confrontando la trasmissione di zanzare di cloni con un diverso numero di trasferimenti seriali di stadi di sangue o numero G (che potrebbe influenzare la gametocitogenesi^32,33),o confrontando i parassiti transgenici direttamente con il tipo selvaggio ingenuo (WT) parassiti che non sono mai stati sottoposti a elettroporazione e selezione di farmaci positivi e alle varie valutazioni non standardizzate dell’esclamazione dei gameti maschili. Pertanto, è fondamentale standardizzare protocolli che sono semplici da seguire per l’analisi fenotipica di qualsiasi tipo di parassiti transgenici o WT roditori della malaria nel sangue e nella zanzara per adattarsi alle variabilità biologiche della malaria roditore specie parassiche.

Qui, riportiamo su un protocollo sperimentale standardizzato e dettagliato per l’analisi fenotipica delle fasi del ciclo di vita del sangue e delle zanzare dei parassiti transgenici o selvatici P. yoelii e P. berghei . Questi protocolli sono applicabili anche ai parassiti P. chabaudi e P. vinckei.