细胞外基质的Glycoproteomics：使用质谱联用完整糖肽分析的方法

这项研究是经旺兹沃思地方研究伦理委员会（参考号码：06 / Q0803 / 37），并从研究和发展办公室获得机构的认可。所有患者签署知情同意书。 1.细胞外基质蛋白的提取注：体外循环期间从心耳获得用于这些实验的人的心房组织，只是心脏的停搏后。所有样品在圣乔治医院，伦敦，英国收集。所有的组织样品必须在-80℃冷冻。不要使用固定剂，如多聚甲醛保存的样品，即交联蛋白。 准备所有提取缓冲液预先实验中，按表1中，为了最小化所述提取步骤之间的时间。在温度受控的环境中执行，在室温（RT）温育所有（ 即，〜20℃），以确保提取之间的一致性。 称取20-50 mg组织的。如果几个样品进行提取，切割和一个衡量他们一个避免组织的完全解冻。使用手术刀，切块的组织成3-4更小的块（ 即，2-3毫米），并一起将它们放入1.5毫升管中。 添加冰冷的磷酸盐缓冲盐水的500μL（PBS; 见表1和材料的数据表 ），并执行五次洗涤，以尽量减少血液污染。 萃取步骤1：与孵育NaCl的缓冲液 用PBS洗涤后，将样品放入1.5mL的管中带螺纹盖。 添加氯化钠缓冲 （ 见表1）以10倍（体积：重量）的组织重量。涡流在RT管用于以最小速度（ 即，600rpm）下1个小时。 注：低涡流速度是至关重要的，以避免在该步骤期间的组织的机械破坏。使用泡沫适配器在提取过程中，将所有管。 转移提取物至新管和离心机中以16000×g离心10分钟，在4℃下。在-20℃下，直到使用存储提取物。简言之洗净用新鲜NaCl缓冲液的剩余的组织颗粒。使用相同类型的缓冲液（ 即，NaCl缓冲液的100μL）进行洗涤，以防止与不同溶解度（ 即，蛋白质用NaCl不可提取）其它蛋白质的提取。 洗涤后，确保完全除去缓冲液以最小化蛋白质含量与随后的提取步骤的重叠。丢弃用于洗涤的NaCl的缓冲液。 注：缓冲体积和组织重量之间的比率为可再现的提取重要。 10：1的比（V：重量）的NaCl和SDS提取和5：1的盐酸胍步骤提供足够量的蛋白质，而不饱和的缓冲区。蛋白质浓度是大约分机后1-2微克/μLraction。 提取步骤2：用脱细胞SDS缓冲液 在十次（ν：w）的添加SDS缓冲液（ 表1）的组织重量;使用低浓度的SDS（ 即，0.1％）是至关重要的，以避免脱细胞过程中的ECM蛋白的损失。涡流在RT管用于以最小速度（ 即，600rpm）下16个小时。 注：低涡的速度减少ECM的机械破坏。 转移提取物到新管。离心在4℃下16000×g离心10分钟;保存在-20℃直至使用。简言之洗剩余组织粒料使用dd H 2 O操作除去SDS。保证清洗后完全去除液体。 提取步骤3：孵育盐酸胍缓冲 （：W v）的组织重量在五次添加盐酸胍缓冲液（ 表1）。涡流在RT管以最大速度（72个小时即 </EM> 3200 RPM）;剧烈涡旋促进ECM的机械破坏。 转移提取物到新管。离心机在16000×g下在4℃下10分钟，并储存在-20℃直至使用。 2.蛋白定量降水注意：由于洗涤剂的存在下，根据在280nm处的吸光度测量的SDS缓冲液是具有直接蛋白质定量不相容。为了确保重现量化，用比色测定所有蛋白提取物17。 量化。 制备标准使用牛血清白蛋白（BSA）的校准曲线在适当的提取缓冲液（ 即，氯化钠，SDS，或盐酸胍）17连续稀释。在此期间，解冻样品的提取物。 稀释的样品中提取缓冲液，以得到内浓度吸光度的线性范围内; 1:10稀释（V：V）得到十分满意的结果。稀释盐酸胍样品用等量DDH 2 O的定量的，作为比色测定法是不与> -4 M盐酸胍浓度相容。 使用二喹啉甲酸（BCA）基比色测定法17（参见材料的表 ），按照在96孔板中测定制造商的说明书;建议至少进行两次重复测量。 孵育30分钟后，取吸光度读数在570nm的波长，以便计算使用BSA标准校准曲线17中的蛋白质浓度。 蛋白质沉淀 解冻盐酸胍提取在室温。等分试样的10微克蛋白质的每个样品放入新的试管中。对于直接的糖肽的分析，等分试样50微克。添加乙醇和INCU 10倍体积的软化过夜，在-20℃。 注：盐酸胍不进一步酶促反应和大多数电泳应用程序兼容。盐酸胍的去除之前去糖基化和胰酶消化是必需的。盐酸胍在乙醇和，的溶解度相反，蛋白质的低溶解度允许有效地除去盐酸胍的同时产生大约蛋白18的98％的回收率。 离心将样品在16000×g的30分钟，在4℃和吸出上清液。注意不要打扰沉淀沉淀。干燥使用真空浓缩器（参见材料的表 ）在室温15分钟的粒料。 注：该协议可以在这里停止，并且储存在-20℃直至使用将干燥的粒料。 可选地，运行凝胶电泳质量控制（QC，参见补充方法 ）。 3.顺序去糖基化的N-糖基化位点占据的评估在样品干燥（参见步骤2.2.2），制备含有脱支去糖基化酶，按照表1中的去糖基化缓冲液中。见材料表产品的详细信息。 添加含酶每个样品去糖基化缓冲的10μL。通过执行快速涡流和样品的降速确保适当的沉淀再悬浮。 注意：在使用脱支酶的糖单体的去除是用于随后的和完全除去O-连接的复合糖的基本和便于通过PNG酶-F N联糖的后切割。 孵育2小时，在25℃，以允许用于除去硫酸乙酰肝素的肝素酶通过的II.Increase温度至37℃，并孵育在温和搅拌36小时。 注意：由于低的反应体积和延长的温育时间，使用培养箱摇床和紧密地挤紧多个1.5mL的桶的50mL锥形管中，在大约45°培养箱内靠在内部ES。 36小时后，离心样品1分钟，在16000×g下 和蒸发 通过使用在室温真空浓缩约45分钟H 2 O，使其脱离样品。 用的H 2 18 O含有50 U / ml的PNG酶-F，10μL重悬干燥的样品进行切割以脱酰胺化反应的所有的天冬酰胺连接的聚糖。 注意：得到的天冬氨酸携带2.98 Da的过量质量指示N-糖基化的MS分析过程中的存在。 在37℃下在振荡培养箱持续搅拌孵育36个小时。 4.在溶液内胰蛋白酶消化注意：此步骤应该两个非去糖基化（ 即，用于直接糖肽分析）和去糖基化的样品进行（ 即，用于聚糖OC的评估cupancy）。 使用总蛋白的10微克用于N-糖基化位点占据的评估（如在前面的步骤表示）。测量用于直接糖肽分析的样品中，使用蛋白质的50微克作为起始量。 注：蛋白质为10μg描述了下列步骤。根据需要扩大第evolumes（ 即，对于50微克5次）。 变性使用9M尿素和3M脲每个样品等分试样中的蛋白质，具有分别6M尿素和2M硫脲，终浓度（ 例如，对于10μL样品，20μL脲/硫脲）。 通过加入100mM的二硫苏糖醇（10毫摩尔DTT，3.33微升，最终浓度）降低蛋白质。孵育37℃以240rpm搅拌1个小时。 通过加入0.5M的碘乙酰胺（：50mM的3.7μL，最终浓度）进行烷基化之前冷却样品至室温。孵育在黑暗中1个小时。 使用预冷（-20℃）丙酮（样品的6倍体积），以在-20℃下过夜孵育样品。通过离心在14,000×g沉淀在4℃下25分钟。 吸出上清液。注意不要打扰沉淀沉淀。干燥使用在室温下30分钟的真空浓缩该蛋白颗粒。 重悬在0.1M三乙基碳酸氢铵（TEAB）缓冲液，pH 8.2的20微升，含有胰蛋白酶（0.01微克/微升），并在37℃和240rpm下消化过夜。 通过酸化，用10％三氟乙酸将样品（TFA，2微升的1％TFA的终浓度）终止消化。 5.肽清理使用C18色谱柱注：消化后从肽混合物干扰污染物的去除降低离子抑制和改善信号噪声比和序列覆盖率。这一步应该两个非去糖基化和去糖基化SA进行mples。 激活在C18喷丝板的树脂（参见材料的表 ），使用每孔和离心机200μL甲醇在1,000×g下1分钟。 通过在1,000×g下将每80％乙腈（ACN）和0.1％TFA的阱200μL在H 2 O.离心1分钟洗净。 通过在1,000×g下将每1个％ACN和0.1％TFA的阱200μL在H 2 O.离心1分钟平衡。重复此步骤两次以上。 从第4步到含有在1,500×g下将树脂和离心1分钟孔加载样品（整个体积）。刷新流过第二次和重复离心。 通过在1,500×g下将每1个％ACN和0.1％TFA的阱200μL在H 2 O.离心1分钟洗净。重复此步骤两次以上。 洗脱用每50％ACN，0.1％TFA的阱170μL的样品中的H 2 O.离心1500×g离心1分钟。重复上一步并结合收集的洗提。 使用真空浓缩，在室温2小时干燥洗脱液。如果它没有被立即使用，保持干燥的样品在-80℃下直到使用。 注意：用于蛋白质鉴定去糖基样品只准备在此步骤之后，以用于LC-MS / MS。步骤6和不需要用于这些样品7。 解冻，重悬在2％ACN和0.05％TFA去糖基化样品中的H 2 O操作的0.5微克/微升的最终蛋白质浓度。步骤6对于非去糖基化的样品的糖肽直接分析进行。 任选地，过滤肽与串联质量标签（TMT）标记前;看到肽fitration的补充方法 。 6.标签与TMT（用于直接糖肽分析只） 解冻，重悬将干燥的粒料在50mM TEAB的50μL，以获得1微克/微升的浓度。 ResusPED TMT零的0.8毫克小瓶（TMT 0，参见材料的表 ）试剂在ACN的41μL。按照制造商的recommendantions再悬浮。 在50种微克的肽的比率标记肽样品至0.4mg TMT 0（ 即，肽的50μL至20.5μLTMT 0）。孵育在室温1个小时。 通过以比6加入5％羟胺淬灭标记反应：100（ 即，4.23 5％羟胺μL）。孵育在室温下15分钟。 干燥TMT 0 -标记的肽样品用于使用真空浓缩器在室温下1个小时。重悬在DDH 2 O的10μL 注意：由于聚糖残基，糖肽显示比非糖基化肽更高的分子量。 TMT 0增加糖的充电状态。这降低了它们的相对质荷（M / Z）的比率并有助于ETD碎片。 7。糖肽富集使用在试剂盒中（参见材料的表 ）提供反应缓冲液。 加的来自步骤6.5的结合缓冲液，每10μL样品50μL。涡glycocapture树脂溶液，直到它变均匀。使用两性离子亲水相互作用液相色谱（ZIC-HILIC）系捕获15。 等分试样50μL的树脂悬浮于新的1.5mL管。自旋为1分钟，在2500×g下，去除上清。添加样品的60μL（ 即，用结合缓冲液将样品）添加到含有树脂颗粒的管中。混合使用移液管，并在1,200rpm下在RT温育在搅动20分钟。 离心2分钟，在2000×g离心，将上清液转移到新管中。保持管。加入洗涤缓冲液150μL到树脂管。混合使用移液管，并在1,200rpm下在RT温育在搅动10分钟。 旋在2500×g下2分钟。转让上清液到同一管（来自步骤7.4）中。重复洗涤步骤两次。 加入75微升洗脱缓冲液，并用吸管混合。搅拌在室温1200 rpm离心5分钟，然后在2500×g下离心管2分钟。转移上清液至新的1.5毫升管中。重复洗涤步骤，然后将洗脱液上清转移到相同的管中。 离心含有的洗脱液（ 即，糖肽）的管2分钟在2500×g下。将上清转移到新的试管中，以确保在前面的步骤中除去任何残留的树脂。 干燥使用真空浓缩，在室温约2小时洗出物整个150μL。重悬干燥向下糖肽在2％ACN的15μL和0.05％TFA在DDH 2 O. 继续使用HCD碎片分析ECM蛋白质组合物进行LC-MS / MS和LC-MS / MS使用HCD和ETD碎裂为糖肽的表征。见第8。 </oL> 8.质谱分析使用HCD碎片分析ECM蛋白质组合物进行LC-MS / MS;见补充方法的细节。 使用HCD和ETD碎裂为糖肽的表征（详见补充方法 ）进行LC-MS / MS;富集的样品应当相比于非富集的输入材料15。 注释：LC-MS / MS方法间接糖分析，直接糖分析和数据库检索的详细描述，在补充方法提供。鼓励有兴趣使用质谱特征ECM的蛋白质和多糖组成的研究人员参考以前的出版物3，11，15。