Análise do induzida por ácido retinóico Neural diferenciação de células estaminais embrionárias rato em corpos embrióides Dois e tridimensionais

CES originam a partir da massa celular interior de blastocistos. Estas células são pluripotentes, isto é, têm a capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de células do organismo de origem. CES diferenciação in vitro é de grande interesse como um sistema experimental para a investigação de vias e de mecanismos de desenvolvimento. Dispõe de um sistema modelo potente e flexível para testar novas abordagens terapêuticas para a correcção da disfunção de células e tecidos. EBs recapitular diversos aspectos da diferenciação celular durante o desenvolvimento embrionário precoce. Em particular, a EBS pode ser utilizado quando a letalidade embrionária torna difícil determinar a base celular dos defeitos embrionárias ^{1, 2.} EBs pode ser formada quer por as gotas de suspensão ou técnicas de suspensão líquidos ^3. A vantagem da primeira é a capacidade de gerar EBs de tamanho e densidade consistente, facilitando assim a reprodutibilidade experimental.

<p class = "jove_content"> A interacção com proteínas de adesão da matriz extracelular (ECM) podem afectar a motilidade e a sobrevivência de células aderentes. No sistema de cultura de 2D, a fibronectina é muitas vezes aplicada para aumentar a adesão de células ao substrato. A fibronectina é uma componente de lâmina basal reconhecido por 10 tipos de superfície celular das integrinas heterodímeros ^4.

RA é um metabolito lipófilo pequeno de vitamina A que induz a diferenciação neuronal ^{5, 6.} Elevadas concentrações de RA promover a expressão do gene neural e reprime a expressão do gene durante mesodérmica EB formação ^{7, 8.} RA é produzido pela oxidação de vitamina A para Retinaldeído por qualquer álcool ou retinol desidrogenase, seguido por oxidação retinaldeído para o produto final por retinaldeído desidrogenase ^9. diferenciação neural requer o transporte de RA a partir do citoplasma para o núcleo através da proteína de ligação celular RA 2 (CRABP2). No núcleo, RA se liga ao seu receptor cognato complexo consistindo de um heterodímero de RAR-RXR ^10. Isto resulta em recrutamento de co-activadores da transcrição, e a iniciação da transcrição ^{9, 11.} Além disso, RA promove a degradação de fosforilada (activa) Smad1, antagonizando assim BMP e sinalização SMAD ^12. Além destas actividades, AR aumenta a expressão Pax6, um factor de transcrição que suporta diferenciação neural ^13. Sinalização RA é modulada por sirtuina-1 (Sirt1), um dinucleótido adenina nicotinamida nuclear (NAD +) – enzima dependente que deacetylates CRABP2, interferindo com a sua translocação para o núcleo e, consequentemente, com a ligação do AR para o heterodímero RAR-RXR ^{14, 15, 16.}

e_content "> A nossa meta na concepção do protocolo EB-tratada RA descrito aqui é para optimizar a diferenciação neuronal, a fim de facilitar a análise in vitro das vias de sinalização que regulam a diferenciação CES em células precursoras neuronais Uma das vantagens deste protocolo. é facilitação de a análise da função das células por imunofluorescência. 3D EB não são bem penetrado por anticorpos e são difíceis de imagem. EB dissociação em uma monocamada 2D em pontos de tempo específicos durante a diferenciação neuronal e facilita a imunomarcação de imagem das células por microscopia confocal.