二维和三维胚体小鼠胚胎干细胞的维甲酸诱导神经分化的分析

胚胎干细胞从胚泡内细胞团起源。这些细胞是多能的， 即它们具有分化成起源的生物体的任何细胞类型的能力。 ESC 体外分化为广泛兴趣，作为调查的发育途径和机制的实验系统。它提供了一个强有力的和灵活的模型系统来测试的细胞和组织功能障碍修正新的治疗方法。 EB的早期胚胎发育过程中重演细胞分化的许多方面。具体地，可以当胚胎致死性使得难以确定胚胎缺陷^1,2的蜂窝式的基础上使用的EB。的EB可以通过悬滴或液体悬浮液技术³形成。前者的优点是，以产生一致的大小和密度的EB中，从而有利于实验的再现性的能力。

<p c小姑娘="“jove_content”">与细胞外基质（ECM）粘附蛋白相互作用可能会影响贴壁细胞的运动性和存活。在2D培养系统，纤连蛋白经常被应用以增加对基底细胞粘附。纤连蛋白是由10种细胞表面的整联异二聚体⁴识别的基底膜成分。

RA是诱导神经分化^5,6维生素A的一小的亲脂性代谢物。高浓度的RA的促进神经基因表达和在EB形成^7,8阻遏中胚层的基因表达。 RA是由维生素A的氧化通过任一醇或视黄醇脱氢酶，随后醛氧化成最终产品通过醛脱氢酶⁹醛生产。神经分化需要从细胞质RA的运输由蜂窝RA-结合蛋白2（CRABP2）细胞核。在细胞核中，RA结合由一个RAR-RXR异二聚体¹⁰的其同源受体复合物。这导致招聘转录共激活因子和转录^9,11的开始。此外，RA促进磷酸化的（活性）SMAD1的降解，从而拮抗BMP和Smad信号^12。除了这些活动，RA增加Pax6的表达，支持神经分化¹³的转录因子。 RA信令由沉默调节蛋白1（Sirt1的），核烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD +）调制-即deacetylates CRABP2，以其易位干扰到细胞核依赖性酶，并因此与RA结合RAR-RXR异二聚体^{14,15 16。}

e_content“>我们在设计这里所述的RA处理的EB协议的目标是为了便于调节ESC分化成神经元前体细胞中的信号传导途径的体外分析，以优化神经分化，其中一个这种协议的优点之一是便利细胞功能的免疫荧光。3D的EB的分析不能很好地穿透抗体和难以成像。EB解离成在特定的时间点的2D单层期间神经分化通过共聚焦显微镜促进免疫标记和细胞的成像。