Малые РНК Трансфекция в первичных человеческих Th17 клеток с помощью следующего поколения электропорации

CD4 ⁺ Т – клетки являются важными оркестраторами адаптивного иммунного ответа. Наивные CD4 ⁺ Т – клетки способны превращаться в нескольких различных эффекторных Т – клеток (например , Th1, Th2, Th17 и т.д.), каждый со своим собственным набором характерных цитокинов и факторов транскрипции, в зависимости от местного микроокружения ^1. Решения линии преемственности, что Т-клетки составляют критичны как для защитного иммунитета и толерантности к себе. Th17 клетки представляют собой одно подмножество Т – клеток , известных для борьбы с внеклеточных бактерий и грибков, но их неправильные ответы также участвуют в патогенезе множества аутоиммунных и воспалительных заболеваний , таких как рассеянный склероз и псориаз ^{2, 3.} Человеческие клетки Th17 могут быть получены из нативных CD4 ⁺ Т – клеток в пробирке путем предоставления им соответствующей поляризационной среды ^4. Vario нас комбинации цитокинов IL-1β, IL-23, TGF-beta, и IL-6 были использованы для развития клеток Th17 человека. Человек Th17 клетки экспрессируют CCR6, рецептор хемокинов , который обычно используется , чтобы идентифицировать эту популяцию клеток и определяется выражением их основного фактора транскрипции, RORγt (кодируемого) RORC ^{5, 6.} Th17 клетки обладают способностью выражать несколько цитокинов, но IL-17A является родословная определяющего эффектор цитокин, продуцируемый этими клетками. Мы исследовали экспрессию всех трех Th17-ассоциированных маркеров (CCR6, RORγt, IL-17A) для оценки надежности нашего человеческого Th17 в пробирке дифференциации анализа. Кроме того, мы культивировали человеческие CD4 ⁺ Т – клеток в неполяризующих условиях, в которых не добавл ли никакого цитокины или блокирующие антитела к культуральной среде , чтобы использовать в качестве отрицательного контроля , так как экспрессия этих маркеров Th17 должно быть очень низким или отсутствует.

ve_content "> Один из способов изучить нормальное развитие клеток человека T и биологии, чтобы манипулировать экспрессии генов в процессе их развития. Краткосрочные вмешательства РНК (миРНК) представляют собой синтетические небольшие молекулы РНК, которые нацелены на белок-кодирующих мРНК, и могут быть использованы для уменьшения специфической экспрессии гена . MicroRNAs (миРНК) является эндогенным некодирующим малым РНКОМ , известным для модуляции экспрессии гена посттранскрипционно. микроРНК , как было показан , играет важную роль как в мышином и биологии Т – клетки человека, в том числе в Th17 клетках ^{7, 8, 9.} Это очень важно иметь надежные методы манипулирования небольшой РНК-активности в Т-клетках человека, чтобы изучить их влияние на экспрессию генов и в конечном счете на человеческой клеточной биологии T. Здесь мы опишем простой в использовании, последовательный и надежный протокол, который мы разработали для введения небольшой синтетический РНК и запертые нуклеиновые кислоты (МШИТ, химически модифицированные нуклеиновые кислоты с повышенной стабильностью)в клетки иммунной системы, а именно в Th17-клеток человека.

Есть несколько альтернативных способов введения малого РНКА в клетки млекопитающих, которые обычно попадают в химические, биологические или физические категории ^10. Обычно используемые химические методы, в том числе на основе липидов и трансфекций кальция-фосфатной трансфекции, полагаются на создание комплексов химико-ДНК, которые более эффективно поглощаются клетками. В общем, химические методы не являются столь эффективными для трансфекции первичных Т-клеток. Наиболее распространенный биологический метод является использование вирусного вектора (например , ретровирус или лентивирус), который непосредственно вставляет внешний РНК в хозяин в качестве части своего естественного цикла репликации. Вирусные трансдукции, как правило, занимает больше времени, чтобы закончить, особенно когда факторы во время для молекулярного клонирования провирусных плазмид. Кроме того, вирусные векторы трансдукции могут быть потенциально опасными для человека исследователей. Электропорация является физическим менит индуцировать мембраны пермеабилизации, подвергая клетки воздействия высоких импульсов напряжения, позволяя нуклеиновые кислоты, чтобы транзиторно войти в камеру, где они могут действовать на своей цели. Традиционные электропорации инструменты не являются эффективными для трансфекции первичных лимфоцитов. Тем не менее, оптимизированная для следующего поколения электропорации, оказалось способной трансфекция Т-клеток при очень высокой эффективности, особенно когда материал для трансфекции мал РНК. Термин следующего поколения свободно используется , чтобы различать две новые платформы (например, неоновые, Amaxa) от традиционных электропорации машин. Кроме того, этот метод легко масштабируется для умеренных экранов пропускной способности с до приблизительно 120 малых РНК в одном эксперименте, часто с использованием проверенных синтетических реагентов. Важно отметить, что успешная трансфекция может быть достигнута в качестве всего лишь 16 ч после активации Т-клеток. Недостаток этого способа, однако, является то, что она не приводит к стабильной геномной incorporatiна, и поэтому преходяще. Следовательно, стоит дополнительных усилия, чтобы создать стабильную экспрессирующую конструкцию, которая может быть упакована в вирусный вектор и успешно высказанную в Т-клетках в тех случаях, когда требуется долгосрочное выражение малой РНК.

Мы использовали следующее поколение трансфекции (например, неон) для доставки различных синтетических одно- или двухцепочечных РНК или МШАТ олигонуклеотидных инструментов для различных целей ^{11, 12, 13.} Эффективное РНК-интерференции может быть вызван в первичной мыши и Т-клеток человека с помощью двухцепочечной короткого вмешательства РНК (миРНК). Этот протокол описывает оптимизированные условия для использования этого метода в клетках Th17 человека. В дополнении к киРНКу, коммерчески доступный синтетический микроРНК подражает и ингибиторы могут быть использованы для изучения усиления микроРНКа и потери функции. микроРНК имитирует являются двухцепочечной молекулы РНК, очень похожие на киРНК, но Дизайнд с последовательностью эндогенного зрелого микроРНКа. ингибиторы микроРНК химически модифицированной РНК и / или LNA на основе одноцепочечных олигонуклеотидов, которые связываются с носителями микроРНК и противодействуют их функции. Мы обнаружили, что все эти инструменты могут быть эффективно использованы в культивируемых первичных Т-лимфоцитов, в том числе, но не ограничиваясь клеток Th17 человека.