Ici, nous présentons un protocole quantitatif et évolutif pour effectuer des écrans de petites molécules ciblés pour les régulateurs de la kinase de la transition pluripotente à apprêt naïf.
Les cellules souches embryonnaires (CES) peuvent s'auto renouveler ou se différencier en tous types de cellules, phénomène connu sous le nom de pluripotence. Des états pluripotents distincts ont été décrits, dénommés pluripotence "naïve" et "apprêtée". Les mécanismes qui contrôlent la transition à l'origine ne sont pas bien compris. En particulier, nous restons mal informés sur les protéines kinases qui spécifient des états pluripotents naïfs et apprêtés, malgré une disponibilité croissante de composés d'outils de haute qualité pour sondage de la fonction kinase. Ici, nous décrivons une plate-forme évolutive pour réaliser des écrans de petites molécules ciblés pour les régulateurs de la kinase de la transition pluripotente à apprêt naïf dans les ESC de souris. Cette approche utilise des conditions simples de culture cellulaire et des réactifs, matériaux et équipements standard pour découvrir et valider les inhibiteurs de la kinase avec des effets jusqu'alors non appréciés sur la pluripotence. Nous discutons des applications potentielles pour cette technologie, y compris le dépistage d'une autre petite moléculeDes collections telles que des inhibiteurs de kinase de plus en plus sophistiqués et des bibliothèques émergentes de composés d'outils épigénétiques.
Les cellules souches embryonnaires (CES) ont la capacité de se renouveler ou de se différencier en n'importe quel type de cellule dans le corps adulte, un phénomène connu sous le nom de pluripotence 1 . Des preuves récentes indiquent qu'il existe des états pluripotents distincts du développement, appelés «pluripotence« naïve »et« apprêtée » 2 . Les CES naïves représentent un état de développement similaire à celui observé dans l'embryon préimplantatif 3 . En revanche, les CES pluripotents préparés sont prêts à sortir de la pluripotence et à se différencier en lignées embryonnaires spécialisées 4 , 5 .
Les états pluripotents naturels et préparés sont marqués par des réseaux distincts de régulation des gènes. La pluripotence naïve se caractérise par l'expression de facteurs de transcription de pluripotence clés tels que Nanog, les facteurs de transcription de type Krueppel (Klfs), Rex1 2 et Esrrb <supClass = "xref"> 6. Dans les CES de souris (MESC), la pluripotence apprêtée se caractérise par une expression réduite des marqueurs naïfs et une signature d'expression génique spécifique qui comprend l'ADN de la méthyltransférase Dnmt3b 7 de novo. In vivo , les cellules souches épiblastiques de post-implantation pluripotente (EpiSCs) 4 , 5 expriment en outre le marqueur Epiblast Fgf5 et les marqueurs d'amorçage de lignée tels que Brachyury 8 .
Les MESC fournissent un modèle traçable aux mécanismes de sondage qui contrôlent in vitro les transitions pluripotentes imprégnées de naïveté. Lorsqu'ils sont cultivés dans le facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) et le sérum bovin fœtal (FBS), les MESC subissent une transition dynamique entre les états pluripotents naïfs et préparés 9 , 10 . Fonctions de signalisation LIF-Jak-Stat3 pour promouvoir un réseau de régulation génétique naïf 11 </Sup>, tandis que la signalisation autocrine via le chemin de croissance 4 du fibroblaste (Fgf4) Erk1 / 2 conduit la transition vers l'état amorcé 12 . Cependant, il reste un défi d'évaluer systématiquement le rôle des protéines kinases dans la spécification d'états pluripotents distincts.
Ici, nous décrivons une plate-forme quantitative et évolutive permettant d'effectuer des écrans de petites molécules ciblés pour les régulateurs de la kinase de la transition pluripotente à apprêt naïf. Nous utilisons des conditions simples de culture du SMESC et des réactifs, des matériaux et des équipements standard pour découvrir et valider les inhibiteurs de kinase avec une capacité jusqu'alors non appréciée à stabiliser la pluripotence naïve. En outre, nous discutons des applications étendues potentielles pour cette technologie, y compris pour le dépistage d'autres collections de petites molécules telles que les bibliothèques d'inhibiteurs émergents ciblant les régulateurs épigénétiques.
Ici, nous démontrons une méthodologie largement accessible pour analyser le rôle des voies de signalisation de la kinase dans la régulation de la transition pluripotente à apprêt naïf. Cela répond à une question clé dans le champ ESC. Bien que les approches génomiques et transcriptomiques à haut débit soient habituellement utilisées pour identifier les principaux régulateurs de la transcription des états pluripotents naturels et apprêtés, les réseaux de signalisation de pluripotence élucidés se sont révélés difficiles. Nous proposons maintenant une stratégie souple employant des inhibiteurs chimiques pour identifier les kinases qui contrôlent la transition pluripotente à l'élaboration naïve dans les MESC. Cela repose sur des équipements, des réactifs et des matériaux simples qui sont disponibles pour la plupart des laboratoires qui étudient la signalisation cellulaire et la biologie ESC. Le développement d'un test rigoureux pour quantifier la transition entre les états pluripotents naïfs et préparés est essentiel au succès de cette plate-forme. L'établissement de cet essai nécessitait des modifications itératives importantes dans le plat cellulaireLa densité, le temps d'incubation des inhibiteurs et les conditions d'immunoblot.
Les approches de petites molécules gagnent une traction pour une utilisation rationnelle dans les applications ESC thérapeutiques 15 , 16 . Une forte résistance au dépistage de petites molécules est que les composés d'outils sont conçus et / ou modifiés pour une absorption cellulaire efficace. L'efficacité de la transfection n'est pas limitante, et l'utilisation de systèmes de livraison dangereux tels que le lentivirus n'est pas nécessaire. En outre, les inhibiteurs inhibent fréquemment des isoformes multiples dans une famille kinase ( p. Ex . Fgfr1-4, Jak1-3), qui surmonte la redondance fonctionnelle qui entrave les techniques d'interférence génétique ou génomique telles que l'ARNi et le CRISPR / Cas9. À mesure que des composés d'outils plus puissants et sélectifs deviennent disponibles à la fois dans des programmes de découverte de médicaments universitaires et pharmaceutiques, les kinases peu étudiées et mal connues seront poussées à l'avant-garde de la recherche ESC. Nous proposons donc que ce haut-Une approche de dépistage approfondie ouvrira de nouvelles avenues de recherche sur les réseaux de base de la CES.
Une limitation mineure de cette technologie est que même les inhibiteurs de petites molécules les plus puissants et sélectifs s'engagent et inhibent de multiples kinases indépendantes in vivo . Cependant, les données de profil de l'inhibiteur de kinase de plus en plus larges permettent d'identifier facilement les cibles fonctionnelles des inhibiteurs de la kinase (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibiteurs). Enfin, en principe, notre plate-forme peut être appliquée pour interroger toute collecte de petites molécules et / ou un dosage cellulaire pour lequel des anticorps immunoblotting de haute qualité sont disponibles. Cela permettra d'étudier de multiples systèmes de régulation dans la régulation de la pluripotence et de faciliter l'identification des inhibiteurs de petites molécules qui modifient divers processus cellulaires. Plus précisément, nous envisageons que l'application de collections émergentes de petites molécules telles que l'épigèneLes sondes tic développées par le Consortium de génomique structurale (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) ont le potentiel de découvrir d'autres régulateurs nouveaux de transitions pluripotentes.
The authors have nothing to disclose.
Le CACW est soutenu par une bourse d'études doctorales en recherche médicale. Le GMF est soutenu en partie par un Prix du chercheur du Medical Research Council (MR / N000609 / 1) et une bourse de recherche Tenovus Scotland.
mESC media | |||
CCE mESCs | ATCC | ATCC SCRC-1023 | |
DMEM Media | Gibco | 11965092 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Final: 2mM |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Final: 50U/ml |
2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Final: 0.1mM |
Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion) | MRC-PPU reagents and services | Final: 100ng/ml | |
Leukemia Inhibitory Factor | Thermo | PMC9484 | Final: 100ng/ml |
Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | Final: 0.1mM |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | Final: 1mM |
KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Final: 5% |
Defined Fetal Bovine Serum | Fisher | 10703464 | Final: 10% |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
TC materials | |||
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo | 25300054 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma | 1890 | |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo | 156545 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190136 | |
V-bottom 96 well plates | Greiner Bio-one | 651261 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lysis Buffer | |||
Tris buffer | VWR | 103157P | |
Sodium Chloride | VWR | 97061 | |
EDTA | Sigma | E4884 | |
1% NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-100g | |
β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
Sodium Pyrophosphate | Sigma | 13472-36-1 | |
Sodium Fluoride | Sigma | 450022 | |
Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243 | |
Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Sigma | CO-RO | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Tween | Sigma | P1379-1L | |
Milk Powder | Marvel | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Western Blotting | |||
Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45uM Pore size (20 X 20cm Sheets) (25 Sheet) | GE | 10401191 | |
Ponceau S | Sigma | P7170-1L | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Laboratory Equipment | |||
Minifold I System | GE | 10447850 | |
ChemiDoc imager | BioRad | 1708280 | |
LiCor Odyssey Imager | LiCor | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
Anti-mouse Nanog | Reprocell | RCAB001P | |
Anti-Dnmt3b | Imgenex | IMG-184A | |
IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit | Licor | 926-32213 | |
Anti-mouse-HRP | Cell Signalling Technology | 7076S | |
Anti-Klf2 | Millipore | 09-820 | |
Anti-Klf4 | R&D Systems | AF3158 | |
Anti-Oct4 | Santa Cruz | sc-5279 |