ここで、我々は、ナイーブプライム多能性転移のキナーゼレギュレーターの標的小分子スクリーニングを実施するための定量的かつスケーラブルなプロトコルを提示する。
胚性幹細胞(ESC)は、自己複製するか、または多能性として知られる現象であるすべての細胞型に分化することができる。明確な多能性状態が記載されており、「ナイーブ」および「下塗り」多能性と呼ばれる。ナイーブプライム遷移を制御するメカニズムはあまり理解されていません。特に、我々は、キナーゼ機能をプローブするための高品質のツール化合物の利用可能性が高まるにもかかわらず、ナイーブ及びプライムされた多能性状態を指定するプロテインキナーゼについて十分に知られていないままである。ここでは、マウスESCにおけるナイーブプライム化多能性転移のキナーゼ調節剤のための標的化された小分子スクリーニングを実施するためのスケーラブルなプラットフォームを記載する。このアプローチは、単純な細胞培養条件および標準的な試薬、材料および装置を利用して、多分化能に対するこれまで評価されていない効果を有するキナーゼ阻害剤を明らかにし、検証する。我々は、この技術の潜在的な用途について論じている。これには、他の小分子ますます洗練されたキナーゼ阻害剤やエピジェネティックなツール化合物の新興ライブラリーなどのコレクションです。
胚性幹細胞(ESC)は、多能性1として知られる現象である、成体における任意の細胞型に自己複製または分化する能力を有する。最近の証拠によれば、発達的に異なる多能性状態が存在し、「ナイーブ」および「プライミング」多能性2と呼ばれる。ナイーブESCは、着床前胚3に見られるものと同様の発達状態を表す。対照的に、初回刺激多能性ESCは、多能性を終了し、特殊な胚系統に分化する4,5 。
ナイーブおよびプライムされた多能性状態は、異なる遺伝子調節ネットワークによって特徴付けられる。ナイーブ多能性は、Nanog、Krueppel様転写因子(Klfs)、Rex1 2およびEsrrbなどの主要多能性転写因子の発現によって特徴付けられる<supclass = "xref"> 6。マウスESC(mESC)では、プライミングされた多能性は、ナイーブマーカーの発現の減少、および特異的なDNAメチルトランスフェラーゼDnmt3b 7を含む特定の遺伝子発現サインを特徴とする。 インビボで 、初回刺激多能性移植後胚盤葉幹細胞(EpiSC) 4,5 は 、EpiblastマーカーFgf5およびBrachyury 8のような系統プライミングのマーカーをさらに発現する。
mESCは、 in vitroでナイーブプライミング多能性移行を制御する機構をプローブするための扱いやすいモデルを提供する。白血病抑制因子(LIF)およびウシ胎児血清(FBS)で培養すると、mESCはナイーブおよびプライムド多能性状態の間で動的な移行を起こす9,10 。ナイーブな遺伝子調節ネットワークを促進するLIF-Jak-Stat3シグナル伝達機能11 </線維芽細胞増殖因子4(Fgf4)Erk1 / 2経路を介した自己分泌シグナル伝達は、初回刺激状態12への移行を促進する。しかしながら、異なる多能性状態を特定する際のプロテインキナーゼの役割を系統的に評価することは依然として課題である。
ここでは、ナイーブプライム化多能性移行のキナーゼ調節剤のための標的化された小分子スクリーニングを行うための定量的かつスケーラブルなプラットフォームを説明する。私たちは単純なmESC培養条件と標準的な試薬、材料と機器を使用して、これまで知られていなかった未知の多能性を安定化させるキナーゼ阻害剤を発見して検証します。さらに、エピジェネティックレギュレーターを標的とする新興インヒビターライブラリーのような他の小分子コレクションのスクリーニングを含む、この技術の潜在的な応用を議論する。
ここでは、ナイーブプライム多能性移行の制御におけるキナーゼシグナル伝達経路の役割を調べるための広くアクセス可能な方法論を示す。これは、ESC分野の重要な問題に取り組んでいます。ナイーブおよびプライムされた多能性状態の主要な転写調節因子を同定するために、ハイスループットのゲノミクスおよび転写ミックスアプローチが日常的に使用されているが、多能性シグナル伝達ネットワークを解明することは困難であることが判明している。私たちは今、mESCにおけるナイーブプライム多能性転移を制御するキナーゼを同定するために、化学的インヒビターを用いる柔軟な戦略を提供する。これは、細胞シグナリングおよびESC生物学を研究するほとんどの研究所で利用可能な単純な機器、試薬および材料に依存する。このプラットフォームの成功にとって重要なのは、ナイーブおよびプライムド多能性状態間の移行を定量化するための堅牢なアッセイの開発です。このアッセイを確立するためには、細胞プレート密度、インヒビターインキュベーション時間およびイムノブロッティング条件。
小分子アプローチは、治療用ESCアプリケーション15,16における合理的使用のための牽引力を獲得している。小分子スクリーニングの主要な強みは、効率的な細胞摂取のためにツール化合物が設計および/または修飾されていることである。トランスフェクション効率は限定されず、レンチウイルスなどの危険な送達系の使用は必要ではない。さらに、インヒビターは、RNAiおよびCRISPR / Cas9のような遺伝的/ゲノム干渉技術を妨げる機能的重複を克服する、キナーゼファミリー内の複数のアイソフォーム( 例えば、 Fgfr1-4、Jak1-3)をしばしば阻害する。より強力で選択的なツール化合物が学術および医薬品創薬プログラムの両方から入手可能になるにつれて、十分に理解されていないキナーゼは、ESC研究の最前線に押し出されます。したがって、我々は、この高いラウンド・プット・スクリーニング・アプローチは、ESCの中核的な規制ネットワークの研究の新たな道を開きます。
この技術の1つの小さな制限は、最も強力で選択的な小分子阻害剤でさえもインビボで複数の無関係なキナーゼに関与し、阻害することである。しかしながら、ますます包括的なキナーゼ阻害剤プロファイリングデータは、キナーゼ阻害剤の機能的標的を容易に同定することを可能にする(http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase – 阻害剤)。最後に、原理的には、高品質イムノブロッティング抗体が利用可能な小分子収集および/または細胞アッセイを調べるために、我々のプラットフォームを適用することができる。これにより、多能性調節における複数の調節系の研究が可能になり、多様な細胞プロセスを改変する小分子阻害剤の同定が容易になる。具体的には、本発明者らは、エピゲンのような新生小分子コレクションStructural Genomics Consortium(http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics)によって開発されているticプローブは、多能性移行のさらなる新規レギュレーターを明らかにする可能性を秘めています。
The authors have nothing to disclose.
CACWは、医学研究評議会博士課程学生の支援を受けています。 GMFは、Medical Research CouncilのNew Investigator Award(MR / N000609 / 1)およびTenovus Scotlandの研究助成金によって一部サポートされています。
mESC media | |||
CCE mESCs | ATCC | ATCC SCRC-1023 | |
DMEM Media | Gibco | 11965092 | |
L-Glutamine | Gibco | 25030081 | Final: 2mM |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | Final: 50U/ml |
2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Final: 0.1mM |
Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion) | MRC-PPU reagents and services | Final: 100ng/ml | |
Leukemia Inhibitory Factor | Thermo | PMC9484 | Final: 100ng/ml |
Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140050 | Final: 0.1mM |
Sodium Pyruvate | Gibco | 11360070 | Final: 1mM |
KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | Final: 5% |
Defined Fetal Bovine Serum | Fisher | 10703464 | Final: 10% |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
TC materials | |||
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo | 25300054 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma | 1890 | |
Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo | 156545 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190136 | |
V-bottom 96 well plates | Greiner Bio-one | 651261 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lysis Buffer | |||
Tris buffer | VWR | 103157P | |
Sodium Chloride | VWR | 97061 | |
EDTA | Sigma | E4884 | |
1% NP-40 | Sigma | 9016-45-9 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750-100g | |
β-glycerophosphate | Sigma | G9422 | |
Sodium Pyrophosphate | Sigma | 13472-36-1 | |
Sodium Fluoride | Sigma | 450022 | |
Sodium Orthovanadate | Sigma | 450243 | |
Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Sigma | CO-RO | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Tween | Sigma | P1379-1L | |
Milk Powder | Marvel | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Western Blotting | |||
Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45uM Pore size (20 X 20cm Sheets) (25 Sheet) | GE | 10401191 | |
Ponceau S | Sigma | P7170-1L | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Laboratory Equipment | |||
Minifold I System | GE | 10447850 | |
ChemiDoc imager | BioRad | 1708280 | |
LiCor Odyssey Imager | LiCor | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies | |||
Anti-mouse Nanog | Reprocell | RCAB001P | |
Anti-Dnmt3b | Imgenex | IMG-184A | |
IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit | Licor | 926-32213 | |
Anti-mouse-HRP | Cell Signalling Technology | 7076S | |
Anti-Klf2 | Millipore | 09-820 | |
Anti-Klf4 | R&D Systems | AF3158 | |
Anti-Oct4 | Santa Cruz | sc-5279 |