Un approccio G-quadruplex del DNA-affinità per purificazione di enzimaticamente attiva G4 Resolvase1
Summary
G4 Resolvase1 lega a strutture G-quadruplex (G4) con ristretti affinità segnalato per una proteina G4 vincolanti e rappresenta la maggioranza dell'attività svolgimento G4-DNA in cellule HeLa. Descriviamo un nuovo protocollo che sfrutta l'affinità e l'attività svolgimento ATP-dipendente di G4-Resolvase1 per purificare specificamente G4R1 ricombinante cataliticamente attivo.
Abstract
strutture di acidi nucleici di ordine superiore chiamato G-quadruplex (G4S, strutture G4) si possono formare in regioni ricche di guanina sia di DNA e RNA e sono altamente stabili termicamente. Ci sono> 375.000 putativi sequenze G4 di formazione nel genoma umano, e si sono arricchiti in regioni promotrici, le regioni non tradotte (UTR), e all'interno della ripetizione telomerica. A causa del potenziale di queste strutture di influenzare processi cellulari, come la replicazione e la trascrizione, la cellula si è evoluta gli enzimi per la loro gestione. Un tale enzima è G4 Resolvase 1 (G4R1), che è stato co-biochimicamente caratterizzata dal nostro laboratorio e Nagamine et al. ed è risultata estremamente legano strettamente sia G4-DNA e G4-RNA (K d nella gamma bassa-PM). G4R1 è la fonte della maggior parte delle attività G4-risolvendo in lisati cellulari HeLa e da allora è stato implicato per svolgere un ruolo nel metabolismo dei telomeri, lo sviluppo della linfa, la trascrizione del gene, emopoiesi, e la sorveglianza immunitaria. La capacità di efficientemente esprimere e purificare cataliticamente attivo G4R1 è di importanza per i laboratori interessati ad approfondire la comprensione dell'interazione cinetica delle strutture G4 ed enzimi G4-risolvere. Qui, descriviamo un metodo dettagliato per la purificazione di ricombinante G4R1 (rG4R1). La procedura descritta incorpora tradizionale purificazione per affinità basata su un enzima istidina-tag C-terminale espressa in batteri codone ottimizzato umani con l'utilizzo della capacità di rG4R1 di legare e distendersi G4-DNA per purificare enzima altamente attivo in una ATP- passo eluizione dipendente. Il protocollo comprende inoltre una fase di controllo di qualità in cui l'attività enzimatica di rG4R1 è misurata esaminando la capacità dell'enzima purificato per rilassarsi G4-DNA. Un metodo è anche descritto che consente la quantificazione purificato rG4R1. adattamenti alternativi di questo protocollo sono discussi.
Introduction
strutture G4 sono strutture secondarie altamente stabili di acido nucleico che si formano nelle regioni ricche di guanina del DNA e RNA. Strutture G4 sono stabilizzati tramite interazioni Hoogsteen-bonding e coordinare l'incollaggio all'interno della cavità centrale con monovalenti cationi (es. K + e Na +) che contribuiscono in modo significativo alla notevole stabilità termica delle strutture G4 1, 2. I primi bioinformatica studi hanno suggerito che il genoma umano contiene> 375.000 "potenziali G4 che formano motivi" 3, 4. Altre stime studio recenti suggeriscono che il numero di G4 motivi è superiore di un fattore del 2,5 5, mentre un altro studio prevede 716,310 potenziali sequenze distinte G4 formano nel genoma umano 6. G4-forming sequenze sono evolutivamente conservata e non disperse in modo casuale ingenoma. Motivi G4 sono arricchiti in gene regioni codificanti, e verso l'alto del 40% di tutti i promotori dei geni contengono G4 motivi 7. È interessante notare che il grado di arricchimento di motivi G4 in un gene è stata dimostrata per suggerire la funzione del gene. Ad esempio, proto-oncogeni e geni coinvolti nello sviluppo hanno significativamente maggiore arricchimento delle strutture G4 di geni oncosoppressori 8, 9.
Con le alte stabilità termica, una presenza quasi onnipresente in tutto il genoma, e il potenziale per influenzare in modo significativo i principali processi cellulari, non è sorprendente scoprire che la cellula si è evoluta enzimi per gestire queste strutture. Uno di questi enzimi è G4 Resolvase1 (G4R1, chiamato anche Rhau e DHX36), che abbiamo caratterizzato come la fonte della maggior parte dei tetramolecular G4-DNA attività risolvere in (HeLa), le cellule umane 10. Da allora, è stato dimostrato that G4R1 ermeticamente lega e cataliticamente snoda tetramolecular e unimolecolare G4-DNA e G4-RNA con i più stretti KD riportato per una proteina G4 vincolante 11, 12, 13. Inoltre, l'attività G4-risolutivo G4R1 è stata implicata in un'ampia gamma di processi biochimici e cellulari, tra telomero / telomerasi biologia 11, 14, 15, 16, trascrizione e splicing 17, 18, 19, 20, di sviluppo 21, ematopoiesi 21, e immune regolazione 22, 23. Con una preponderanza di sequenze G4 situato specificamente nel genoma e diversificata p cellularerocesses che G4R1 è stato recentemente implicato di essere coinvolti con, la capacità di esprimere in modo efficiente e purificare altamente attiva rG4R1 sarà della massima importanza per chiarire i meccanismi biochimici e comportamenti di questa proteina.
Qui, dimostriamo un romanzo espressione e di schema di purificazione (Figura 1) che sfrutta l'ATP-dipendente, l'attività G4-risolutivo rG4R1 per isolare in modo efficace enzima attivo. Questo schema potrebbe essere adattato per purificare altri enzimi acido nucleico ATP-dipendente in cui il prodotto della reazione enzimatica non è più un substrato per il legame, come è il caso per G4R1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo rappresenta un'espressione, purificazione e quantificazione schema altamente efficiente per l'isolamento del prodotto genico DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, chiamato anche Rhau e DHX36) (Figura 1). Questo protocollo utilizza due fasi di purificazione: His-tag affinità purificazione su perline affinità cobalto e purificazione enzimatica su perline G4-DNA-coniugato. Quest'ultimo passo è unico in quanto sfrutta l'affinità stretta, alta specificità e l'attività catali…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare i nostri fonti di finanziamento, tra cui un dono generoso della Fondazione Ware (a JPV), Il National Institutes of HealthGrant T32-CA079448 (a PJS), e fondi di avvio Università Ball State (a PJS). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.
Materials
| TriEx4-DHX36 plasmid | Addgene | 68368 | |
| Rosetta2(DE3)plysS competent cells | Novagen | 71403-4 | |
| S.O.C medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Difco Terrific Broth | Becton Dickinson | 243820 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Carbenicillin (plant cell culture tested) | Sigma-Aldrich | C3416 | 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| Lysozyme (from chicken egg white) | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| 1 M Tris-HCl pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 1963-B | or From standard source |
| 1 M Tris-HCl pH=7 | Universal Scientific Supply Co. | 1966 | or From standard source |
| 1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 | For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-HCl, pH=6.8 | For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source | ||
| 1 M Tris-Acetate, pH=7.8 | Universal Scientific Supply Co. | 1981 | or From standard source |
| 70% Ethanol | From standard source | ||
| Magnesium chloride (1 M solution) | Life Technologies | AM9530G | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750 | |
| 20x SSC | Universal Scientific Supply Co. | 1665 | or From standard source |
| β-mercaptoethanol (2-BME) | Sigma-Aldrich | 63689 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8849 | |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma-Aldrich | L8511 | |
| Streptavidin paramagnetic beads | Promega | Z5482 | |
| 0.5 M EDTA, pH=8 | Universal Scientific Supply Co. | 0718 | or From standard source |
| 0.2 M EDTA, pH=6 | Universal Scientific Supply Co. | From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl. | |
| A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) | Sigma-Aldrich | L5385 | |
| Cobalt metal affinity beads | Clonetech | 635502 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8000 | |
| Acetic acid, glacial | Fisher Scientific | A38-500 | |
| Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) | Sigma | A7699 | |
| 40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) | Biorad | 161-0148 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS) |
| 10 % Sodium dodecyl sulfate | Universal Scientific Supply Co. | 1667 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source |
| 10x TBE | Sigma-Aldrich | 11666703001 | or From standard source |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source |
| TEMED | Sigma-Aldrich | 411019 | |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Broad Range Protein MW markers | Promega | V8491 | |
| Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") | Oligos Etc | 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’ | |
| TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") | Oligos Etc | 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’ | |
| Fluor-coated TLC plate | Life Technologies | AM10110 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F2637 | 30% in H2O |
| Coomassie R-250 | Sigma-Aldrich | 27816 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 | |
| Multiband UV lamp | Capable of emitting UV light at 365 nm | ||
| Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Microcentrifuge | Capable of being cooled to 4 °C | ||
| Digital Sonfier | Branson | Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF) | |
| 50 °C water bath | For formation of Z33 into quadruplex | ||
| 37 °C incubator for bacteria | For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| 37 °C/14 °C shaking incubator for bacteria | For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36 | ||
| Spectrophotometer | capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000) | ||
| Thermometer | From standard source | ||
| PCR strip tubes | From standard source | ||
| 15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) | From standard source | ||
| Microcentrifuge tubes (2.0 ml) | From standard source | ||
| 500 ml centrifuge bottles (polypropylene) | Thermo Scientific | 3141-0500 | |
| Standard array of pipet tips and serological pipettes | From standard source | ||
| Gel-loading tips | From standard source | ||
| Automatic repeating pipette | For quick aliquoting of rG4R1; From standard source | ||
| Thermal cycler | From standard source | ||
| Liquid Nitrogen | From standard source | ||
| Dry ice | From standard source | ||
| Laemlli sample buffer | Biorad | 161-0737 | |
| Apparatus for running large slab gels | Biorad | We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad | |
| Magnet | Life Technologies | 12301D | We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement |
| Razor blades | From standard source | ||
| Filter paper and funnel | From standard source | ||
| Glass casserole dish | From standard source | ||
| Orbital shaker | From standard source | ||
| Kimwipes | From standard source | ||
| Clear sheet protectors | From standard source | ||
| Scanner and associated TWAIN software | From standard source | ||
| Image analysis software | Such as Fuji Multiguage, or equivalent | ||
| Microsoft Excel | Or equivalent |
Referências
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