Summary

G-квадруплекс ДНК-сродства подход для очистки ферментативно активной G4 Resolvase1

Published: March 18, 2017
doi:

Summary

G4 Resolvase1 связывается с G-квадруплексных (G4) структур с тайтового сообщенной сродства к G4-связывающего белка и представляет большинство разматывания активности G4-ДНК в клетках HeLa. Мы опишем протокол романа, использующую сродство и АТФ-зависимый разматывания активность G4-Resolvase1 специфически очистить каталитически активный рекомбинантный G4R1.

Abstract

структуры высшего порядка нуклеиновых кислот под названием G-квадруплексы (G4S, G4 структуры) могут образовываться в гуанин богатых регионах ДНК и РНК и высокой термостойкостью. Есть> 375000 предположительные G4 формирования последовательностей в геноме человека, и они обогащены промоторной области, нетранслируемые области (НТО), и в пределах теломерном повтора. Из-за возможности эти структуры, чтобы влиять на клеточные процессы, такие как репликации и транскрипции, клетка эволюционировала ферменты, чтобы управлять ими. Одним из таких ферментов является G4 Resolvase 1 (G4R1), который биохимически совместно характеризуется нашей лаборатории и Нагамине и др. и нашел чрезвычайно плотно и к G4-ДНК и РНК-G4 (K D в диапазоне низких фазовую) связываться. G4R1 является источником большинства G4-разрешения активности в лизатах HeLa клеток и с тех пор было вовлечено играть определенную роль в теломер метаболизма, развитие лимфатического, транскрипции генов, кроветворения и иммунного надзора. Возможность Е.Ф.статочно экспрессировать и очистить каталитически активным G4R1 имеет важное значение для лабораторий, заинтересованных в получении дальнейшее понимание кинетического взаимодействия G4 структур и G4-решения ферментов. Здесь мы опишем подробный способ очистки рекомбинантного G4R1 (rG4R1). Описанная процедура включает традиционные аффинной очистки на основе из С-концевого гистидина-меченый фермент, экспрессированный в человеческих оптимизированной в отношении кодонов бактерий с использованием способности rG4R1 связывать и разматывать G4-ДНК для очистки высоко активного фермента в АТФ зависимой стадию элюирования. Протокол также включает в себя этап контроля качества, где ферментативная активность rG4R1 измеряется путем изучения способности очищенного фермента раскрутиться G4-ДНК. Способ также описывается, что позволяет для количественного определения очищенного rG4R1. Альтернативные приспособления этого протокола обсуждаются.

Introduction

G4 структуры обладают высокой стабильностью нуклеиновых кислот, вторичные структуры, которые формируются в пределах гуанин богатых участков ДНК и РНК. G4 структуры стабилизируются с помощью Хугстена-связывающих взаимодействий и координировать соединение в пределах центральной полости с одновалентных катионов (например. K + и Na +) , которые вносят значительный вклад в замечательный термостойкости G4 конструкций 1, 2. Ранние биоинформатики исследования позволяют предположить , что геном человека содержит> 375000 "потенциальные G4 образующие мотивы" 3, 4. Другие оценки недавние исследования позволяют предположить , что число G4 мотивов раза выше 2-5 5, в то время как другое исследование предсказывает 716,310 различные потенциальные последовательности G4 формирования в геноме человека 6. G4-формовка последовательности эволюционно консервативны и не рассредоточено вгеном. G4 мотивы обогащены генов , кодирующих областей, и свыше 40% всех промоторов генов содержат G4 мотивы 7. Интересно отметить, что степень обогащения G4 мотивов в гене было продемонстрировано, чтобы предложить функцию гена. Например, прото-онкогенов и генов , участвующих в развитии , имеют значительно большее обогащение G4 структур , чем генов – супрессоров 8, 9.

С высокой термостабильности, почти повсеместное присутствие по всему геному, и потенциал, чтобы существенно повлиять на основные клеточные процессы, то неудивительно, чтобы обнаружить, что клетка эволюционировала ферменты для управления этими структурами. Одним из таких ферментов является G4 Resolvase1 (G4R1, называемый также RHAU и DHX36), которое мы охарактеризовали как источник большинства tetramolecular G4-ДНК – разрешающего активности в человека (HeLa) клеток 10. С тех пор было показано, тхат G4R1 прочно связывается и каталитически раскручивается tetramolecular и мономолекулярному G4-ДНК и РНК-G4 с стесненных сообщившим KDS для G4-связывающего белка 11, 12, 13. Кроме того, G4-разрешения активность G4R1 участвует в широком диапазоне биохимических и клеточных процессов, в том числе теломер / теломеразы биологии 11, 14, 15, 16, транскрипции и сплайсинга 17, 18, 19, 20, развитие 21, кроветворение 21 и регуляции иммунной системы 22, 23. С перевес G4 последовательностей специфически расположенной по всему геному и разнообразной клеточной рrocesses, что G4R1 недавно был замешан быть связан с, способностью выражать и эффективно очищать высокоактивной rG4R1 будет иметь огромное значение для выяснения биохимических механизмов и поведения этого белка.

Здесь мы покажем новую схему экспрессии и очистки (Рисунок 1) , который использует АТФ-зависимый, G4-разрешения деятельности rG4R1 эффективно изолировать активный фермент. Эта схема может быть приспособлена для очистки других АТФ-зависимых ферментов нуклеиновых кислот, для которых продукт ферментативной реакции больше не является субстратом для связывания, как это имеет место для G4R1.

Protocol

1. Получение структур G4-ДНК, предназначенных для очистки rG4R1 (образование биотинилированного G4-ДНК G-Quadruplex) Заказать следующий олигомер ДНК, названный Z33-Био, в 1-масштабе мкмоль: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-биотин 3'. Убедитесь, что биотин фрагмент находится в 'конце олигомера 3. </l…

Representative Results

Этот протокол (рис 1) обычно дает почти чистый, каталитически активный rG4R1. В качестве меры ферментативной активности, то , как правило , наблюдается , что 50% от 0,2 пмоль TAMRA-меченого tetramolecular G4-ДНК превращается в мономеры в пределах 0,2 – диапазоне 0,013 мкл rG4R1, анализируемый с помощью а?…

Discussion

Этот протокол представляет собой высокоэффективную экспрессии, очистки и схему количественного определения для выделения продукта гена DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, называемый также RHAU и DHX36) (рисунок 1). Этот протокол использует две стадии очистки: His-Tag аффинной очистки на кобальтовых срод…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить наших источников финансирования, в том числе щедрый подарок от Ware Foundation (до JPV), Национальные институты HealthGrant T32-CA079448 (к PJS), а также средства запуска Ball State University (к PJS). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи.

Materials

TriEx4-DHX36 plasmid Addgene 68368
Rosetta2(DE3)plysS competent cells Novagen 71403-4
S.O.C medium Thermo Fisher Scientific 15544034 
Difco Terrific Broth Becton Dickinson 243820
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919 35 µg/ml in bacterial plates/large cultures
Carbenicillin (plant cell culture tested) Sigma-Aldrich C3416 50 µg/ml in bacterial plates/large cultures
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I6758
Lysozyme (from chicken egg white) Sigma-Aldrich L6876
1 M Tris-HCl pH=8 Universal Scientific Supply Co.  1963-B or From standard source
1 M Tris-HCl pH=7 Universal Scientific Supply Co.  1966 or From standard source
1.5 M Tris-HCl, pH=8.8 For casting resolving gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-HCl, pH=6.8 For casting stacking gel (for protein quantitation gel); From standard source
1 M Tris-Acetate, pH=7.8 Universal Scientific Supply Co.  1981 or From standard source
70% Ethanol From standard source
Magnesium chloride (1 M solution) Life Technologies AM9530G
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium acetate Sigma-Aldrich S8750
20x SSC Universal Scientific Supply Co.  1665 or From standard source
β-mercaptoethanol (2-BME) Sigma-Aldrich 63689
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich P8849
Leupeptin hemisulfate Sigma-Aldrich L8511
Streptavidin paramagnetic beads Promega Z5482
0.5 M EDTA, pH=8  Universal Scientific Supply Co.  0718 or From standard source
0.2 M EDTA, pH=6 Universal Scientific Supply Co.  From standard source; initially adjust pH with NaOH, then adjust pH back down with HCl.  
A-lactalbumin (Type 1 from bovine milk) Sigma-Aldrich L5385
Cobalt metal affinity beads Clonetech 635502
L-Histidine Sigma-Aldrich H8000
Acetic acid, glacial Fisher Scientific A38-500
Adenosine 5'-Triphosphate (from bacterial source) Sigma A7699
40% acrylamide/Bis solution (37.5:1) Biorad 161-0148
Glycine Sigma-Aldrich 50046 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS)
10 % Sodium dodecyl sulfate  Universal Scientific Supply Co.  1667 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); or From standard source
10x TBE  Sigma-Aldrich 11666703001 or From standard source
Tris base Fisher Scientific BP152-1 to make protein gel running buffer (192 mM glycine, 25 mM Tris Base, 0.1% SDS); From standard source
TEMED Sigma-Aldrich 411019
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678
Broad Range Protein MW markers Promega V8491
Biotinylated Z33 oligo ("Z33-Bio") Oligos Etc 5’ AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotin 3’
TAMRA-Z33 oligo ("Z33-TAM") Oligos Etc 5’ TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3’
Fluor-coated TLC plate Life Technologies AM10110
Ficoll Sigma-Aldrich F2637 30% in H2O
Coomassie R-250 Sigma-Aldrich 27816
Methanol Fisher Scientific A412
Multiband UV lamp Capable of emitting UV light at 365 nm
Table-top centrifuge (with swinging bucket rotor) Capable of being cooled to 4 °C
Microcentrifuge Capable of being cooled to 4 °C
Digital Sonfier Branson Or equivalent capable of delivering sonication pulses (30% amplitude, 2s ON 2s OFF)
50 °C water bath For formation of Z33 into quadruplex
37 °C incubator for bacteria For bacterial transformations and initial overnight growth of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
37 °C/14  °C shaking incubator for bacteria For growth and protein induction of large cultures of Rosetta2 E. coli transformed with TriEx4-DHX36
Spectrophotometer capable of reading OD600; capable of reading oligomer concentrations based on base sequence (such as Biorad SmartSpec 3000)
Thermometer From standard source
PCR strip tubes From standard source
15- and 50-ml centrifuge tubes (polypropylene) From standard source
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) From standard source
500 ml centrifuge bottles (polypropylene) Thermo Scientific 3141-0500
Standard array of pipet tips and serological pipettes From standard source
Gel-loading tips From standard source
Automatic repeating pipette For quick aliquoting of rG4R1; From standard source
Thermal cycler From standard source
Liquid Nitrogen From standard source
Dry ice From standard source
Laemlli sample buffer  Biorad 161-0737
Apparatus for running large slab gels Biorad We have used the Protean II xi cell apparatus from Biorad
Magnet Life Technologies 12301D We use a magnet from One Lambda (Now a Thermo Fisher Scientific brand); and Life is also a subsidiary of Thermo, and thus the magnet listed here should be a suitable replacement
Razor blades From standard source
Filter paper and funnel From standard source
Glass casserole dish From standard source
Orbital shaker From standard source
Kimwipes From standard source
Clear sheet protectors From standard source
Scanner and associated TWAIN software From standard source
Image analysis software Such as Fuji Multiguage, or equivalent
Microsoft Excel Or equivalent 

Referências

  1. Qin, Y., Hurley, L. H. Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions. Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).
  2. Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes. Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).
  3. Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).
  4. Huppert, J. L., Balasubramanian, S. Prevalence of quadruplexes in the human genome. Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).
  5. Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter. Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).
  6. Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M., Mergny, J. L. G-quadruplexes and helicases. Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).
  7. Huppert, J. L., Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).
  8. Eddy, J., Maizels, N. Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome. Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).
  9. Eddy, J., et al. G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes. Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).
  10. Vaughn, J. P., et al. The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).
  11. Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary. Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).
  12. Creacy, S. D., et al. G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates. J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).
  13. Giri, B., et al. G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA. Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).
  14. Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme. Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).
  15. Sexton, A. N., Collins, K. The 5′ guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation. Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).
  16. Smaldino, P. J., et al. Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3′-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding. PLoS One. 10 (7), e0132668 (2015).
  17. Booy, E. P., et al. The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1. Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).
  18. Huang, W., et al. Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5′-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1. Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).
  19. Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU. Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).
  20. Yoo, J. S., et al. DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation. PLoS Pathog. 10 (3), e1004012 (2014).
  21. Lai, J. C., et al. The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis. Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).
  22. Zhang, Z., et al. DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells. Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).
  23. Kim, T., et al. Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).
  24. Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU. Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).
  25. Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU. Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).

Play Video

Citar este artigo
Routh, E. D., Creacy, S. D., Beerbower, P. E., Akman, S. A., Vaughn, J. P., Smaldino, P. J. A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1. J. Vis. Exp. (121), e55496, doi:10.3791/55496 (2017).

View Video