Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.
Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.
Se estima que las plantas producen más de 200.000 diferentes tipos de compuestos químicos 1. Sólo la minoría de estos compuestos parece jugar un papel en el metabolismo primario de las plantas, que alimenta el crecimiento y la reproducción; la mayoría son los denominados metabolitos secundarios. A pesar de su nombre, metabolitos secundarios son a menudo críticos para la supervivencia y reproducción de las plantas, ya que sirven para atraer a los polinizadores o defender la planta contra patógenos y herbívoros 1.
Los glucosinolatos son una clase muy diversa de metabolitos secundarios que se han estudiado durante más de 150 años 2. Hasta la fecha, más de 130 glucosinolatos estructuralmente diferentes se han identificado 3. En términos generales, los glucosinolatos se pueden subdividir en diferentes clases basadas en el aminoácido de la que se sintetizan. glucosinolatos indol, por ejemplo, se sintetizan a partir del aminoácidotriptófano, mientras que la fenilalanina proporciona el esqueleto de base para la síntesis de glucosinolatos aromáticos 4. Dentro de las clases, hay un alto grado de diversidad estructural, que se produce por los pasos de elongación de la cadena secuencial en el rutas biosintéticas, tales como en la clase de glucosinolatos alifáticos, o por modificaciones de la cadena lateral (por ejemplo, hidroxilación) 4, 5. Una especie de planta de glucosinolatos pueden contener hasta 37 glucosinolatos diferentes que pertenecen a diferentes clases estructurales 6. A pesar de que las especies de plantas tienen perfiles típicos de glucosinolatos, la variación intraespecífica de los tipos de glucosinolatos se encuentran con frecuencia entre los individuos y las poblaciones 6, 7. Glucosinolatos intactos se almacenan en las vacuolas de las células vegetales y se pueden encontrar en cualquier órgano sobre el suelo o bajo el suelo 7, <sup class = "xref"> 8, 9. En caso de rotura celular (por ejemplo, por los herbívoros), glucosinolatos se liberan y se mezclan con la enzima mirosinasa, lo que desencadenó una bomba de aceite de mostaza 10. Debido a la actividad de la mirosinasa, y dependiendo de la estructura de la glucosinolatos, las condiciones de reacción, y la presencia de enzimas modificadoras, se forman diferentes compuestos picantes, tóxicos, o nocivos, tales como nitrilos y (iso) tiocianatos 11. Los productos de reacción tienen altas actividades biológicas; por ejemplo, sirven como repelentes de insectos herbívoros generalistas 12. La heredabilidad y la biosíntesis de glucosinolatos vías están bien estudiados, principalmente debido a su importancia para (glucorafanina) efectos positivos sobre la salud humana 5 herbívoro y resistencia a patógenos, su valor como componentes de sabor en mostazas y coles, y su negativo (progoitrin) y, </sup> 13, 14.
Debido a la gran interés en glucosinolatos como compuestos, métodos de extracción y detección biológicamente activos basados en la cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (HPLC) equipado con radiación ultravioleta (UV) o matriz de fotodiodos (PDA) detectores se han utilizado comúnmente desde la década de 1980 15 . Sobre la base de este método, las Comunidades Europeas emitió un protocolo estándar que fue probado y validado en varios laboratorios para el análisis de los glucosinolatos en las semillas oleaginosas (Brassica napus, colza, canola 16). Otros añaden a este método (por ejemplo, mediante la determinación de los factores de respuesta adicionales para glucosinolatos que no están presentes en violación de semillas oleaginosas) 17. A pesar de la creciente disponibilidad de plataformas de líquidos (LC-MS) de espectrometría de cromatografía de masa y protocolos de alto rendimiento para el análisis de glucosinolatos 18 <sup>, 19, el método HPLC-UV / PDA original, es aún ampliamente utilizado por los científicos. Las principales razones son que este método es sencillo, rentable y relativamente accesible a los laboratorios sin una extensa infraestructura de conocimiento-química analítica. Para servir a esta comunidad, que aquí detalladamente el protocolo para la extracción de glucosinolatos de materiales vegetales y el análisis de sus formas desulfo con HPLC-PDA.
Las mayores ventajas de este método establecido y ampliamente utilizado es que es robusto, bastante sencillo, y relativamente bajo costo por muestra. La mayoría de los equipos necesarios para la extracción y el análisis deben estar disponibles en un laboratorio estándar o puede ser auto-construida, con la excepción de la HPLC-PDA. Otra ventaja es que desulfoglucosinolates disueltos en agua son químicamente muy estable cuando se mantiene fresco y en viales (HPLC) estancos al aire, por lo que los extractos pueden ser fácilmente enviadas para el análisis de HPLC en otros lugares. En contraste con las plataformas LC-MS, que requieren formación y amplia experiencia práctica de la gestión del software y el análisis de los datos especializadas, HPLC-UV / PDA se pueden ejecutar con facilidad después de un corto periodo de formación. Esto no sólo reduce los costes del procedimiento, sino que también hace que este método sea más accesible a una amplia gama de los científicos, incluyendo a los estudiantes.
Generalmente, cuando los procedimientos descritos anteriormente se siguen carefuLLY, deben producirse algunos problemas. En general, los picos de glucosinolatos están muy bien separados en el cromatograma. Si este no es el caso, el programa de gradiente podría adaptarse por la disminución de la tasa de aumento de acetonitrilo en el eluyente. Por otra parte, la construcción de una nueva pre-columna (200-500 inyecciones) o columna (1.500 -2.000 inyecciones) puede resolver el problema. De vez en cuando, cromatogramas de muestras individuales en un lote pueden mostrar muy pequeño o ningún pico. Esto es generalmente debido a los errores de pipeteo cuando se añade la sulfatasa (por ejemplo, una columna o se ha omitido la sulfatasa no se lava adecuadamente hacia abajo en la columna). Por otra parte, la concentración de glucosinolatos en los materiales experimentales pueden haber sido menor de lo esperado y se utilizó muy poco material para la extracción. Si el último es el caso, el volumen de inyección se puede incrementar a 100 l, o una parte alícuota exacta (por ejemplo, 800 l) del extracto puede ser concentrado. Este último podría lograrse mediante secado por congelacióning el extracto, disolviendo el residuo en un volumen más pequeño (por ejemplo, 100 l) de agua, y reinyectar usando la misma curva de referencia. En los cálculos de la concentración original del extracto, los números deben ser multiplicados por el factor de dilución. Si esto no resuelve el problema, los materiales deben ser extraídos de nuevo utilizando más material de partida. Si esta es más de 100 mg, el volumen de los disolventes de extracción y el tamaño de los tubos deben ajustarse proporcionalmente para mantener la eficacia de la extracción.
Una ventaja adicional es que este método ha sido bien validado. Esto se debe a que ha sido descrito como un método estándar para la cuantificación de los glucosinolatos en semilla de colza, para los que se confirmaron los procedimientos y exactitud en varios laboratorios 16. Además, los antecedentes genéticos, la biosíntesis, y funciones biológicas de glucosinolatos están sujetas a intensos esfuerzos de investigación, en el modEL especies de plantas Arabidopsis thaliana entre otros 4, 6, 12. Por lo tanto, muchos factores de respuesta para la cuantificación exacta de desulfoglucosinolates en relación con sinigrin están bien definidos y disponibles públicamente 15,17. A pesar de que los protocolos basados en LS-MS son más de alto rendimiento, más sensible, y son capaces de (tentativamente) identificar glucosinolatos para los que no hay normas están disponibles 18, 19, 20, la falta de factores de respuesta universales para LC-MS limita la la cuantificación exacta de las concentraciones de glucosinolatos 18. Además, estos métodos generalmente no incluyen una etapa de liofilización, y la cantidad de agua en el material de planta fresca es no contabilizado en los cálculos, por lo que la cuantificación exacta difícil. Por último, porque nuestro método de extracción consiste en una columna de basela purificación y la etapa de concentración, también se puede aplicar a muestras "sucias" con bajas concentraciones de glucosinolatos, como los suelos 21.
En comparación con los métodos basados en LC-MS que por lo general extraen recién materiales congelados, utilizan placas de 96 pocillos para la extracción, y no incluyen una etapa de sulfatasa 18, 19, nuestro método es relativamente mucho tiempo y mano de obra intensa. Con los bastidores de las columnas descritas en el presente documento, una sola persona puede extraer cerca de 100-150 muestras en un solo día. Elución (día siguiente), secado por congelación (durante la noche), y volver a disolver puede tener lugar dentro de los siguientes dos días. Con un inyector automático de HPLC, un tiempo de ejecución y el equilibrio de 40-45 minutos por inyección, y que no surjan imprevistos, se tardaría 3-4 días para adquirir los datos para este conjunto de muestras. Cuando el software de HPLC permite la cuantificación automática basada en la curva sinigrin, una comprobación manual de los cromatogramas y PEak asignaciones para 100 muestras sólo podrán tomar otro 1 o 2 horas antes de que los datos pueden ser utilizados para los análisis estadísticos.
A pesar de la creciente disponibilidad de las normas de glucosinolatos, sólo una pequeña fracción de los más de 130 candidatos actualmente se puede adquirir en el comercio. Sin embargo, con algunas referencias para cada una de las clases de biosíntesis; el acceso a bases de datos bibliográficas que especifican los compuestos que se encuentran previamente en las especies de plantas (por ejemplo, Fahey et al. 22); conocimiento básico de los principios cromatográficos, tales como la lógica de la serie eluotrópica (por ejemplo, para un número creciente de Cs en la cadena lateral en los compuestos alifáticos, las Figuras 3 y 4); y la validación de las muestras individuales en LC-MS 19 o glucosinolatos aislados en RMN 23, uno puede fácilmente superar esta limitación. La mayoría de los protocolos para el análisis de glucosinolatos utilizar curvas de referencia internos(Es decir, una cierta concentración para la extracción de sinigrin o sinalbina un disolvente de extracción 16, 17, 19). Principalmente, las curvas de referencia internos son más apropiados para corregir los errores de procesamiento de muestras individuales y, por tanto, teóricamente, producir una mayor precisión. A pesar de esta ventaja, se prefiere utilizar una curva de referencia externa de cinco puntos, ya que a menudo analizamos diferentes especies silvestres, algunas de las cuales contienen altos niveles de sinigrin (por ejemplo, Brassica nigra 24) o sinalbina (por ejemplo, Sinapis alba 25), el dos referencias de glucosinolatos para el que los factores de respuesta están disponibles. Por otra parte, la adición de estándares internos para cada muestra aumenta el costo de los análisis, como patrones de referencia de glucosinolatos de alto grado suelen ser bastante caros.
En conclusión, a pesar de los pasos que requieren mucho tiempo, este protocoloproporciona un método sencillo y accesible para extraer y cuantificar los glucosinolatos en muestras de plantas. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los niveles de glucosinolatos en sí son sólo una indicación de la potencial actividad biológica, visto como la necesidad de reaccionar con mirosinasa, y la variación en los productos de reacción se pueda derivar de un único glucosinolatos 11. Los ensayos de validación deben llevarse a cabo para confirmar la relevancia biológica.
The authors have nothing to disclose.
NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University Tübingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).
Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20,864,320 | |
Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
HCL | VWR | 1,090,571,000 | |
Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
(−)-Sinigrin hydrate from horseradish |
Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
Ethanol | VWR | 20,816,298 | |
Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
Glass /wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
2 mL reaction tubes | VWR | 211-2606 | |
Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
Acetonitril super gradient grade | VWR | 83,639,320 | |
Water bath | VWR | 462-5112 | |
Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
Flask 1000 mL | VWR | 215-1595 | |
Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |