Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.
Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.
Es wird geschätzt , dass die Pflanzen mehr als 200.000 verschiedene Arten von chemischen Verbindungen 1 erzeugen. Nur die Minderheit dieser Verbindung scheint eine Rolle in der Pflanzen primären Stoffwechsel, die Brennstoffe Wachstum und Reproduktion zu spielen; die meisten sind so genannte Sekundärmetaboliten. Trotz ihres Namens sind sekundäre Stoffwechsel oft entscheidend für das Überleben der Pflanze und Reproduktion, wie sie dienen Bestäuber anzulocken oder die Pflanze gegen Krankheitserreger und Pflanzenfressern 1 zu verteidigen.
Glucosinolate sind eine sehr heterogene Gruppe von sekundären Metaboliten, die 2 für mehr als 150 Jahren untersucht worden. Bis heute wurden mehr als 130 strukturell verschiedenen Glucosinolate wurden 3 identifiziert. Im Großen und Ganzen können Glucosinolate in verschiedene Klassen auf der Aminosäurebasis unterteilt werden, aus denen sie synthetisiert werden. Indolglucosinolaten, sind beispielsweise aus der Aminosäure synthetisiertTryptophan, Phenylalanin während liefert das Grundgerüst für die Synthese von aromatischen Glucosinolaten 4. Innerhalb von Klassen, gibt es eine hohe strukturelle Vielfalt, die um etwa sequentielle Kettenverlängerungsschritte in den Biosynthesewegen, wie in der Klasse der aliphatischen Glucosinolaten, oder durch Seitenkettenmodifikationen (zB Hydroxylierung) 4, 5 gebracht wird. Eine Glukosinolat Pflanzenarten können bis zu 37 verschiedene Glucosinolate aus unterschiedlichen Strukturklassen 6. Auch wenn Pflanzenarten typisch Glucosinolatprofile haben, wird innerartliche Variation für die Typen von Glucosinolaten häufig zwischen den Individuen und Populationen 6 gefunden, 7. Intact Glucosinolate sind in den Vakuolen von Pflanzenzellen gespeichert und kann in jeder der oberirdischen oder unterirdischen organ 7, finden <sup class = "xref"> 8, 9. Bei der Zellbruch (zB durch Herbivorie) werden Glucosinolate freigesetzt und mit dem Enzym Myrosinase gemischt, das Setzen einer Senfölbombe 10 ab. Aufgrund der Aktivität von Myrosinase, und auf der Struktur der Glucosinolat abhängig, den Reaktionsbedingungen und der Anwesenheit von modifizierenden Enzymen, verschiedenen scharf, giftig oder gesundheitsschädliche Verbindungen gebildet werden , wie Nitrile und (iso) Thiocyanate 11. Die Reaktionsprodukte haben eine hohe biologische Aktivitäten; beispielsweise dienen sie als Abschreckungsmittel von Generalisten Insektenpflanzenfressern 12. Die Erblichkeit und Biosynthesewege von Glucosinolaten sind gut untersucht, vor allem wegen ihrer Bedeutung für die Pflanzenfresser und Pathogen – Resistenz, ihren Wert als Aromakomponenten in mustards und Kohl, und ihre negativen (Progoitrin) und positive (glucoraphanin) Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit 5, </sup> 13, 14.
Wegen des großen Interesses an Glucosinolaten als biologisch aktive Verbindungen, Extraktion und Detektionsverfahren basierend auf Umkehrphasen – Hochdruck – Flüssigkeitschromatographie (HPLC) , ausgerüstet mit ultraviolettem (UV) oder Photodiodenarray (PDA) Detektoren sind seit den 1980er Jahren 15 allgemein verwendet worden . Auf der Grundlage dieser Methode, erteilt die Europäischen Gemeinschaften ein Standardprotokoll , das für die Analyse von Glucosinolaten in Ölsaaten (Brassica napus, Raps, Canola 16) in mehreren Labors getestet und validiert wurde. Andere aufgenommen zu dieser Methode (zB durch zusätzliche Responsefaktoren für Glucosinolate Bestimmung , die nicht in Raps sind) 17. Trotz der zunehmenden Verfügbarkeit von Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) Plattformen und Hochdurchsatz – Protokolle für Glucosinolatanalyse 18 <sup>, 19, die ursprüngliche HPLC-UV / PDA – Methode ist immer noch weit von den Wissenschaftlern verwendet. Die Hauptgründe dafür sind, dass diese Methode einfach ist, kostengünstig, und relativ leicht zugänglich zu den Labors ohne eine umfangreiche chemisch-analytischen Wissensinfrastruktur. Um zu dienen, diese Gemeinschaft, die wir hier ausführlich das Protokoll für die Extraktion von Glucosinolaten aus Pflanzenmaterialien und die Analyse ihrer Desulfo-Formen mit HPLC-PDA.
Die größten Vorteile dieser etablierten und am häufigsten verwendeten Verfahren sind, dass sie robust ist, ziemlich einfach und relativ niedriger Kosten pro Probe. Der größte Teil der Ausrüstung für die Extraktion und Analyse erforderlich sind, sollte in einem Standard-Labor zur Verfügung oder können mit Ausnahme der HPLC-PDA selbst gebauten, sein. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass desulfoglucosinolates in Wasser gelöst sind chemisch recht stabil, wenn sie kühl und luftdicht (HPLC) Fläschchen gehalten, so dass die Extrakte könnten leicht an anderer Stelle für die HPLC-Analyse versendet werden. Im Gegensatz zu LC-MS-Plattformen, die die Software für die Verwaltung und Analyse der Trainingsdaten und umfangreiche praktische Erfahrung erfordern spezielle, HPLC-UV / PDAs können problemlos nach einer kurzen Einarbeitungszeit ausgeführt werden. Dies reduziert nicht nur die Kosten des Verfahrens, sondern macht auch dieses Verfahren für ein breites Spektrum von Wissenschaftlern, darunter Studenten.
Im Allgemeinen, wenn die vorstehend geschilderten Verfahren befolgt werden beschrieben carefully, sollten einige Probleme auftreten. In der Regel werden die Glucosinolat Spitzen sehr gut in dem Chromatogramm getrennt. Ist dies nicht der Fall ist, könnte das Gradientenprogramm durch Verringern der Steigerungsrate von Acetonitril in dem Eluenten angepasst werden. Alternativ kann das Problem lösen Gebäude in einem neuen Vorsäule (200-500 Injektionen) oder Spalte (1500 -2000 Injektionen). Gelegentlich Chromatogramme einzelner Proben in einer Charge zeigen können sehr kleine oder keine Spitzen. Dies ist in der Regel aufgrund Pipettierfehler wenn die Sulfatasen Zugabe (zB eine Spalte übersprungen wurde oder der Sulfatase nicht richtig nach unten in die Säule gewaschen). Alternativ kann der Glucosinolat-Konzentration in den experimentellen Materialien niedriger als erwartet und zu wenig Material wurde für die Extraktion verwendet. Wenn letzteres der Fall ist, kann das Injektionsvolumen auf 100 & mgr; l erhöht werden, oder eine genaue Aliquot (beispielsweise 800 & mgr; l) der Extrakt konzentriert werden konnte. Letzteres könnte durch Gefriertrocknungs erreicht werdening des Extrakts, der Rückstand in einem kleineren Volumen (beispielsweise 100 & mgr; l) Wasser löst und Reinjezierung die gleichen Bezugskurve. In den Berechnungen für die ursprüngliche Konzentration des Extrakts, sollten die Zahlen mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert. Wenn dies das Problem nicht lösen, sollten die Materialien wieder mehr Ausgangsmaterial verwendet werden, extrahiert. Wenn diese mehr als 100 mg ist, sollte das Volumen der Extraktionslösungsmittel und die Größe der Röhren proportional die Extraktionseffizienz aufrechtzuerhalten eingestellt werden.
Ein zusätzlicher Vorteil ist, dass diese Methode gut validiert wurde. Dies ist , weil es als Standardverfahren zur Quantifizierung von Glucosinolaten in Raps beschrieben worden ist , bei denen die Verfahren und Genauigkeit wurden 16 in mehreren Labors bestätigt. Darüber hinaus sind die genetischen Hintergrund, Biosynthese und biologischen Funktionen von Glucosinolaten Gegenstand intensiver Forschungsanstrengungen, die in model Pflanze Arabidopsis thaliana unter anderem 4, 6, 12. Daher sind viele Reaktionsfaktoren für die genaue Quantifizierung von desulfoglucosinolates in Bezug auf sinigrin gut definiert und öffentlich verfügbar 15,17. Auch wenn LS-MS-basierte Protokolle mehr mit hohem Durchsatz sind, empfindlicher, und sind in der Lage (vorläufig) identifizieren Glucosinolate , für die keine Standards verfügbar sind 18, 19, 20, das Fehlen von Universal-Response – Faktoren für die LC-MS begrenzt die exakte Quantifizierung von Glucosinolat Konzentrationen 18. Hinzu kommt, dass diese Verfahren in der Regel kein Gefriertrocknungsschritt umfassen, und die Wassermenge in dem Frischpflanzenmaterial nachgewiesenes in den Berechnungen exakte Quantifizierung schwierig macht. Schließlich, weil unser Extraktionsverfahren eine spaltenbasierte beinhaltetReinigungs- und Konzentrationsschritt kann es auch 21 mit geringen Konzentrationen an Glucosinolaten, wie Böden zu "schmutzigen" Proben angewendet werden.
Im Vergleich zu LC-MS-basierte Methoden , die in der Regel frisch gefrorene Materialien zu extrahieren, verwenden 96-Well – Platten für die Extraktion, und beinhalten keine Sulfatsulfatase Schritt 18, 19, ist unser Verfahren relativ zeitaufwendig und arbeits intensiv. Mit den Säulengestelle in diesem Papier beschrieben, kann eine einzelne Person etwa 100-150 Proben an einem Tag zu extrahieren. Elution (am nächsten Tag), Gefriertrocknen (über Nacht), und wieder Auflösen kann innerhalb der nächsten zwei Tage stattfinden. Mit einem automatisierten HPLC-Injektor, einem Lauf und Ausgleichszeit von 40-45 min pro Injektion und keine unvorhergesehenen Ereignisse, würde es 3-4 Tage, um die Daten für dieses Beispiel Set zu erwerben. Wenn die HPLC-Software ermöglicht die automatische Quantifizierung basierend auf der sinigrin Kurve, eine manuelle Überprüfung der Chromatogramme und peak-Zuweisungen für 100 Proben können nur eine weitere 1 oder 2 h, bevor die Daten für statistische Analysen verwendet werden können.
Trotz der zunehmenden Verfügbarkeit von Glucosinolat Standards, nur ein kleiner Bruchteil der mehr als 130 Kandidaten derzeit im Handel gekauft werden können. Doch mit ein paar Referenzen für jede der Biosynthese Klassen; Zugang zu Literatur – Datenbanken gefunden , die die Verbindungen vorher in den Pflanzenarten spezifiziert (zB Fahey et al . 22); Grundkenntnisse der chromatographischen Prinzipien wie die Logik der Elutrope Reihe (beispielsweise für Zahlen von Cs an der Seitenkette in aliphatischen Verbindungen zunimmt, 3 und 4); und die Validierung einzelner Proben auf LC-MS 19 oder isoliert Glucosinolaten auf NMR 23, kann man leicht diese Einschränkung zu überwinden. Die meisten Protokolle für Glukosinolat analysiert interne Referenzkurven verwenden(Dh eine bestimmte Konzentration für die Gewinnung von Sinigrin oder Sinalbin zu dem Extraktionslösungsmittel 16, 17, 19). Grundsätzlich sind interne Referenzkurven besser geeignet für einzelne Probenverarbeitungsfehler zu korrigieren und damit theoretisch eine höhere Genauigkeit erzielen. Trotz dieses Vorteils bevorzugen wir einen Fünf-Punkte externe Referenzkurve zu verwenden, wie oft wir verschiedene Wildarten zu analysieren, von denen einige ein hohes Maß an sinigrin enthalten (zB Brassica nigra 24) oder Sinalbin (zB Sinapis alba 25), die zwei Glukosinolat Referenzen für die Responsefaktoren zur Verfügung stehen. Außerdem jeder Probe interne Standards Zugabe erhöht die Kosten der Analysen, als hochwertige Standards Glucosinolat Referenz sind in der Regel ziemlich teuer.
Abschließend trotz der zeitraubenden Schritte, dieses Protokollbietet eine einfache und zugängliche Methode Glucosinolate in Pflanzenproben zu extrahieren und zu quantifizieren. Jedoch ist es wichtig zu berücksichtigen , dass die Glucosinolatgehalte selbst sind nur einen Hinweis auf die mögliche biologische Aktivität, wie die Notwendigkeit mit Myrosinase zu reagieren zu sehen ist , und die Variation in den Reaktionsprodukten aus einem einzigen Glucosinolat 11 entstehen können. Validierungstests müssen durchgeführt werden, um die biologische Relevanz zu bestätigen.
The authors have nothing to disclose.
NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University Tübingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).
Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20,864,320 | |
Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
HCL | VWR | 1,090,571,000 | |
Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
(−)-Sinigrin hydrate from horseradish |
Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
Ethanol | VWR | 20,816,298 | |
Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
Glass /wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
2 mL reaction tubes | VWR | 211-2606 | |
Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
Acetonitril super gradient grade | VWR | 83,639,320 | |
Water bath | VWR | 462-5112 | |
Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
Flask 1000 mL | VWR | 215-1595 | |
Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |