Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.
Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.
Estima-se que as plantas produzem mais de 200.000 diferentes tipos de compostos químicos 1. Apenas uma minoria destes composto parece desempenhar um papel no metabolismo primário das plantas, o qual alimenta o crescimento e reprodução; a maioria são os chamados metabólitos secundários. Apesar do seu nome, metabólitos secundários são frequentemente críticos para a sobrevivência e reprodução das plantas, uma vez que servem para atrair polinizadores ou para defender a planta contra patógenos e herbívoros 1.
Glucosinolatos são uma classe muito diversificado de metabólitos secundários que têm sido estudados há mais de 150 anos 2. Até à data, mais de 130 glucosinolatos estruturalmente diferentes foram identificados 3. Em termos gerais, os glucosinolatos pode ser subdividida em classes diferentes com base no aminoácido a partir do qual eles são sintetizados. glucosinolatos de indolo, por exemplo, são sintetizados a partir do aminoácidotriptofano, fenilalanina Considerando que proporciona o esqueleto de base para a síntese de 4 glucosinolatos aromáticos. Nas classes, há um elevado grau de diversidade estrutural, que é provocada por etapas sequenciais de alongamento da cadeia em vias biossintéticas, tais como na classe de glucosinolatos alifáticos, ou por modificações da cadeia lateral (por exemplo, hidroxilação) 4, 5. Uma das espécies de plantas em glucosinolatos pode conter até 37 glucosinolatos diferentes pertencentes a diferentes classes estruturais 6. Apesar de espécies de plantas têm perfis glucosinolatos típicos, variação intraespecífica para os tipos de glucosinolatos é freqüentemente encontrada entre os indivíduos e populações 6, 7. Glucosinolatos intactos são armazenados nos vacúolos das células vegetais e podem ser encontrados em nenhum dos órgãos acima do solo ou abaixo do solo 7, <sup class = "xref"> 8, 9. Após a ruptura de células (por exemplo, por herbivoria), glucosinolatos são liberados e são misturados com a enzima mirosinase, desencadeando uma bomba de óleo de mostarda 10. Devido à actividade de mirosinase, e, dependendo da estrutura do glucosinolato, as condições de reacção, e a presença de enzimas modificadoras, diferentes compostos pungentes, tóxicas ou nocivas são formados, tais como nitrilos e (iso) tiocianatos 11. Os produtos de reacção têm altas actividades biológicas; por exemplo, eles servem como repelentes de insetos herbívoros generalistas 12. A hereditariedade e biossintéticas vias de glucosinolatos são bem estudadas, principalmente por causa de sua importância para herbívoro e resistência de patógenos, seu valor como componentes de sabor em mostardas e couves, e sua negativa (progoitrin) e efeitos positivos (glucoraphanin) na saúde humana 5, </sup> 13, 14.
Por causa do grande interesse em glucosinolatos como compostos, métodos biologicamente activas de extracção e detecção com base em cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa (HPLC), equipado com radiação ultravioleta (UV) ou o agrupamento de fotodíodos (PDA) detectores de ter sido utilizada desde a década de 1980 15 . Com base neste método, as Comunidades Europeias emitido um protocolo padrão que foi testado e validado em vários laboratórios para a análise de glucosinolatos em sementes oleaginosas (Brassica napus, colza, canola 16). Outros adicionado a este método (por exemplo, determinando os factores de resposta para glucosinolatos adicionais que não estão presentes nas sementes de colza) 17. Apesar da crescente disponibilidade de espectrometria de cromatografia de massa plataformas líquidos (LC-MS) e protocolos de alto rendimento para a análise de glucosinolatos 18 <sup>, 19, o método HPLC-UV / PDA originais ainda é bastante usada pelos cientistas. As principais razões são que este método é simples e de baixo custo, e relativamente acessível a laboratórios, sem uma extensa infra-estrutura de conhecimento químico-analíticos. Para servir esta comunidade, nós aqui detalhadamente o protocolo para a extração de glucosinolatos partir de materiais vegetais ea análise de suas formas desulfo com HPLC-PDA.
As maiores vantagens deste método estabelecido e amplamente utilizado é que ela é robusta, bastante simples e relativamente de baixo custo por amostra. A maior parte do equipamento necessário para a extracção e análise devem estar disponíveis em um padrão de laboratório ou podem ser auto-construído, com a excepção de o HPLC-PDA. Outra vantagem é que desulfoglucosinolates dissolvidos em água são quimicamente muito estável quando mantido frio e em (HPLC) frascos hermeticamente fechados, de modo que os extractos poderia ser facilmente enviado para análise por HPLC em outro lugar. Em contraste com plataformas LC-MS, que exigem formação e vasta experiência prática para a gestão do software e análise de dados especializados, HPLC-UV / PDAs pode ser facilmente executado depois de um curto período de treinamento. Isto não só reduz os custos do processo, mas também torna este método mais acessível para uma ampla gama de cientistas, incluindo estudantes.
Geralmente, quando os procedimentos descritos acima são seguidos carefully, alguns problemas devem ocorrer. Em geral, os picos de glucosinolato são muito bem separados no cromatograma. Se este não for o caso, o programa de gradiente pode ser adaptado por diminuir a taxa de aumento de acetonitrilo no eluente. Em alternativa, a construção de uma nova pré-coluna (200-500 injeções) ou coluna (1.500 -2.000 injeções) podem resolver o problema. Ocasionalmente, cromatogramas de amostras únicas em um lote pode mostrar muito pequeno ou nenhum pico. Isto é geralmente devido a erros de pipetagem ao adicionar o sulfatases (por exemplo, uma coluna foi ignorado ou a sulfatase não foi devidamente lavado para dentro da coluna). Alternativamente, a concentração de glucosinolatos nos materiais experimentais pode ter sido menor do que o esperado e muito pouco material foi utilizado para a extracção. Se este for o caso, o volume de injecção pode ser aumentada para 100? L, ou uma alíquota exacta (por exemplo, 800 ul) de o extracto pode ser concentrado. Esta última poderia ser conseguida por congelamento-secoing o extracto, dissolução do resíduo num volume mais pequeno (por exemplo, 100 mL) de água, e reinjecção usando a mesma curva de referência. Nos cálculos para a concentração original do extrato, os números devem ser multiplicados pelo factor de diluição. Se isto não resolve o problema, os materiais devem ser extraídas novamente utilizando mais material de partida. Se este é mais do que 100 mg, o volume dos solventes de extracção e o tamanho dos tubos deve ser ajustado proporcionalmente para manter a eficiência da extracção.
Uma vantagem adicional é que este método tem sido bem validada. Isso é porque ele tem sido descrito como um método padrão para a quantificação dos glucosinolatos em colza, para os quais os procedimentos e precisão foram confirmadas em vários laboratórios 16. Além disso, o fundo genético, a biossíntese, e as funções biológicas de glucosinolatos estão sujeitos a esforços intensos de investigação, no model espécies de plantas de Arabidopsis thaliana, entre outros 4, 6, 12. Por isso, muitos factores de resposta para a quantificação exacta de desulfoglucosinolates em relação ao sinigrin são bem definidas e divulgadas publicamente 15,17. Apesar de protocolos baseados no LS-MS são mais de alto rendimento, mais sensível, e são capazes de (tentativamente) identificar glucosinolatos para os quais não há padrões estão disponíveis 18, 19, 20, a falta de factores de resposta universais para LC-MS limita o quantificação exacta das concentrações de glucosinolatos 18. Além disso, estes métodos geralmente não inclui um passo de liofilização, e a quantidade de água no material de planta fresco é desaparecidos nos cálculos, tornando difícil a quantificação exacta. Por último, porque o nosso método de extração envolve uma base colunapurificação e o passo de concentração, que também pode ser aplicado a amostras "sujas" com baixas concentrações de glucosinolatos, tais como solos 21.
Em comparação com os métodos baseados em LC-MS, que normalmente extrair recém materiais congelados, utilizam placas de 96 poços, durante a extracção, e não incluem um passo de sulfatase 18, 19, o nosso método é relativamente moroso e de trabalho intenso. Com as prateleiras de coluna descritas neste documento, uma única pessoa pode extrair cerca de 100-150 amostras em um dia. Eluição (dia seguinte), congelar secagem (overnight), e re-dissolução pode ocorrer nos dois dias seguintes. Com um injector automático HPLC, uma corrida e equilíbrio de tempo de 40-45 minutos por injeção, e sem imprevistos, levaria 3-4 dias para obter os dados para este conjunto de amostras. Quando o software de HPLC permite a quantificação automático com base na curva sinigrin, uma verificação manual dos cromatogramas e PEatribuições ak para 100 amostras só pode tomar outro 1 ou 2 h antes de os dados podem ser usados para análises estatísticas.
Apesar da crescente disponibilidade de padrões de glucosinolatos, apenas uma pequena fração dos mais de 130 candidatos atualmente pode ser comercialmente comprado. No entanto, com algumas referências para cada uma das classes biossintéticas; acesso a bases de dados de literatura que especifiquem os compostos anteriormente encontrados nas espécies de plantas (por exemplo, Fahey et al 22.); conhecimento básico dos princípios cromatograf icos, tais como a lógica de série eluotropic (por exemplo, para um número crescente de Cs na cadeia lateral nos compostos alifáticos, as Figuras 3 e 4); e a validação de amostras simples de LC-MS 19 ou glucosinolatos isolados no RMN 23, pode-se facilmente ultrapassar esta limitação. A maioria dos protocolos de glucosinolatos analisa usar curvas de referência internos(Isto é, uma certa concentração para a extracção de sinigrin ou sinalbin para a extracção por solvente 16, 17, 19). Principalmente, as curvas de referência internos são mais apropriadas para corrigir erros de processamento de amostras individuais e, assim, teoricamente, produzir uma maior precisão. Apesar desta vantagem, é preferível utilizar uma curva de referência externo de cinco pontos, como frequentemente analisar diferentes espécies selvagens, alguns dos quais contêm níveis elevados de sinigrin (por exemplo, Brassica nigra 24) ou sinalbin (por exemplo, Sinapis alba 25), o duas referências glucosinolatos para o qual factores de resposta estão disponíveis. Além disso, a adição de padrões internos a cada amostra, aumenta o custo das análises, como padrões de referência de alto grau de glucosinolatos são geralmente muito caros.
Em conclusão, apesar das etapas demoradas, este protocoloproporciona um método simples e acessíveis para extrair glucosinolatos e quantificar em amostras de plantas. No entanto, é importante considerar que os níveis de glucosinolato em si são apenas uma indicação do potencial de actividade biológica, visto que a necessidade de reagir com mirosinase, e a variação nos produtos de reacção pode surgir a partir de uma única glucosinolatos 11. Os ensaios de validação devem ser realizados para confirmar a relevância biológica.
The authors have nothing to disclose.
NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University Tübingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).
Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20,864,320 | |
Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
HCL | VWR | 1,090,571,000 | |
Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
(−)-Sinigrin hydrate from horseradish |
Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
Ethanol | VWR | 20,816,298 | |
Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
Glass /wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
2 mL reaction tubes | VWR | 211-2606 | |
Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
Acetonitril super gradient grade | VWR | 83,639,320 | |
Water bath | VWR | 462-5112 | |
Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
Flask 1000 mL | VWR | 215-1595 | |
Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |