Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.
Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.
On estime que les plantes produisent plus de 200 000 différents types de composés chimiques 1. Seule la minorité de ces composés semble jouer un rôle dans le métabolisme primaire des plantes, ce qui alimente la croissance et la reproduction; la majorité sont dits métabolites secondaires. Malgré leur nom, les métabolites secondaires sont souvent critiques pour la survie des plantes et de la reproduction, car ils servent à attirer les pollinisateurs ou pour défendre la plante contre les agents pathogènes et les herbivores 1.
Les glucosinolates sont une classe très variée de métabolites secondaires qui ont été étudiés depuis plus de 150 ans 2. À ce jour, plus de 130 glucosinolates structurellement différents ont été identifiés 3. De manière générale, les glucosinolates peuvent être divisés en différentes classes en fonction de l'acide aminé à partir duquel ils sont synthétisés. glucosinolates indoliques, par exemple, sont synthétisés à partir de l'acide aminéle tryptophane, la phénylalanine alors que fournit le squelette de base pour la synthèse de glucosinolates de 4 aromatiques. À l'intérieur des classes, il existe une grande diversité structurelle, qui est provoquée par séquentielles étapes d'allongement de chaîne dans les voies biosynthétiques, tels que la classe de glucosinolates aliphatiques, ou par des modifications de chaînes latérales (par exemple, hydroxylation) 4, 5. Une espèce végétale glucosinolates peuvent contenir jusqu'à 37 glucosinolates différents appartenant à différentes classes structurales 6. Même si les espèces végétales ont des profils typiques de glucosinolates, variation intraspécifique pour les types de glucosinolates est fréquente chez les individus et les populations 6, 7. Glucosinolates intacts sont stockés dans les vacuoles des cellules végétales et peuvent être trouvés dans tout organe ou hors sol hypogée 7, <sup class = "xref"> 8, 9. Lors de la rupture des cellules (par exemple, par herbivorie), glucosinolates sont libérés et sont mélangés avec l'enzyme myrosinase, déclenchant une bombe à l' huile de moutarde 10. En raison de l'activité de la myrosinase, et en fonction de la structure du glucosinolate, les conditions de réaction, et la présence d'enzymes de modification, les différents composés âcres, toxiques ou nocives sont formés, tels que les nitriles et les (iso) 11 isothiocyanates. Les produits de réaction ont des activités biologiques élevées; par exemple, ils servent de répulsifs d'insectes herbivores généralistes 12. Les héritabilité et biosynthétiques voies de glucosinolates sont bien étudiés, principalement en raison de leur importance pour herbivore et la résistance aux pathogènes, leur valeur en tant que composants de saveur dans les moutardes et les choux, et le négatif (progoitrine) et (glucoraphanin) les effets sur la santé humaine 5 positifs, </sup> 13, 14.
En raison du grand intérêt pour les glucosinolates en tant que composés, des procédés d'extraction et de détection biologiquement actifs à base de Chromatographie en phase liquide à haute pression en phase inversée (HPLC) munie d'ultraviolets (UV) ou un réseau de photodiodes (PDA) détecteurs ont été couramment utilisés depuis les années 1980 15 . Sur la base de cette méthode, les Communautés européennes ont publié un protocole standard qui a été testé et validé dans plusieurs laboratoires pour l'analyse des glucosinolates dans les graines oléagineuses (Brassica napus, colza, canola 16). D' autres ont ajouté à cette méthode (par exemple, en déterminant les facteurs de réponse supplémentaires pour les glucosinolates qui ne sont pas présents dans le colza) 17. Malgré la disponibilité croissante de liquide spectrométrie de chromatographie de masse (LC-MS) des plates – formes et de protocoles à haut débit pour l' analyse de glucosinolates 18 <sup>, 19, la méthode HPLC-UV / PDA d' origine est encore largement utilisé par les scientifiques. Les principales raisons sont que cette méthode est simple, rentable et relativement accessible aux laboratoires sans une vaste infrastructure de connaissances en chimie analytique. Pour servir cette communauté, nous voici en détail le protocole pour l'extraction de glucosinolates à partir de matières végétales et l'analyse de leurs desulfo-formes par HPLC-PDA.
Les plus grands avantages de cette méthode établie et largement utilisé est qu'il est robuste, assez simple, et relativement faible coût par échantillon. La plupart de l'équipement nécessaire pour l'extraction et l'analyse devraient être disponibles dans un laboratoire standard ou peut être construit soi-même, à l'exception de l'HPLC-PDA. Un autre avantage est que desulfoglucosinolates dissous dans l'eau sont chimiquement très stables lorsqu'ils sont conservés au frais et (HPLC) des flacons étanches à l'air, de sorte que les extraits peuvent être facilement transportés pour l'analyse HPLC ailleurs. Contrairement aux plates-formes LC-MS, qui nécessitent une formation et une expérience pratique de la gestion du logiciel et de l'analyse des données spécialisées, HPLC-UV / PDA peuvent être facilement exécutés après une courte période de formation. Cela réduit non seulement les coûts de la procédure, mais rend également cette méthode plus accessible à un large éventail de scientifiques, y compris les étudiants.
En règle générale, lorsque les procédures décrites ci-dessus sont suivies savoully, quelques problèmes se produisent. En général, les pics de glucosinolates sont très bien séparées dans le chromatogramme. Si cela est le cas, le programme de gradient peut être adapté en diminuant le taux d'augmentation de l'acétonitrile dans l'éluant. Sinon, la construction d'une nouvelle pré-colonne (200-500 injections) ou une colonne (1500 -2000 injections) peut résoudre le problème. De temps en temps, chromatogrammes des échantillons individuels dans un lot peuvent montrer très petit ou pas de pics. Ceci est généralement dû à des erreurs de pipetage lors de l' ajout de la sulfatase (par exemple, une colonne a été sautée ou sulfatase n'a pas été correctement arrosé dans la colonne). En variante, la concentration en glucosinolates dans les matériaux expérimentaux peuvent avoir été plus faible que prévu, et trop peu de matière a été utilisée pour l'extraction. Si celui – ci est le cas, le volume d'injection peut être augmentée jusqu'à 100 pi, ou une aliquote exacte (par exemple 800 pi) de l'extrait peut être concentré. Celle-ci peut être obtenue par lyophilisationtion de l'extrait, en dissolvant le résidu dans un petit volume (par exemple 100 pi) de l' eau, et réinjectant en utilisant la même courbe de référence. Dans les calculs de la concentration initiale de l'extrait, les chiffres doivent être multipliés par le facteur de dilution. Si cela ne résout pas le problème, les matériaux doivent être extraits à nouveau en utilisant plus de matériau de départ. Si tel est supérieure à 100 mg, le volume des solvants d'extraction et la taille des tubes doit être ajustée proportionnellement pour maintenir l'efficacité de l'extraction.
Un avantage supplémentaire est que ce procédé a été bien validé. En effet , il a été décrit comme une méthode standard pour la quantification des glucosinolates dans le colza, pour lesquels les procédures et la précision ont été confirmées dans plusieurs laboratoires 16. En outre, l'arrière-plan génétique, la biosynthèse et les fonctions biologiques des glucosinolates font l'objet d'intenses efforts de recherche dans le model espèces de plantes Arabidopsis thaliana entre autres , 4, 6, 12. Par conséquent, de nombreux facteurs de réponse pour la quantification exacte de desulfoglucosinolates par rapport à sinigrine sont bien définis et accessibles au public 15,17. Même si les protocoles basés sur LS-MS sont plus à haut débit, plus sensibles, et sont capables de (provisoirement) identifier les glucosinolates pour lesquels aucune norme sont disponibles 18, 19, 20, l'absence de facteurs de réponse universelle pour LC-MS limite la quantification exacte des concentrations de glucosinolates 18. En outre, ces procédés ne comprennent habituellement pas d'étape de lyophilisation, et la quantité d'eau dans la matière végétale fraîche non comptabilisée dans les calculs, ce qui rend difficile la quantification exacte. Enfin, parce que notre méthode d'extraction implique une base de colonnela purification et l' étape de concentration, il peut également être appliquée à des échantillons "sales" avec de faibles concentrations de glucosinolates, tels que les sols 21.
Par rapport aux méthodes basées sur la LC-MS qui extraient habituellement fraîchement matériaux congelés, utilisent des plaques à 96 puits pour l' extraction, et ne comprennent pas une étape de sulfatase 18, 19, notre méthode est relativement longue et le travail intense. Avec les supports de colonne décrits dans le présent document, une seule personne peut extraire environ 100-150 échantillons en une seule journée. Elution (lendemain), lyophilisation (la nuit), et re-dissolution peut avoir lieu dans les deux jours suivants. Avec un injecteur automatique de HPLC, un temps de 40-45 minutes par injection terme et équilibration, et aucun événement imprévu, il faudrait 3-4 jours pour acquérir les données de cet ensemble d'échantillons. Lorsque le logiciel de HPLC permet la quantification automatique basée sur la courbe sinigrine, une vérification manuelle des chromatogrammes et pemissions ak pour 100 échantillons ne peuvent prendre une autre 1 ou 2 h avant que les données peuvent être utilisées pour des analyses statistiques.
Malgré la disponibilité croissante des normes de glucosinolates, seule une petite fraction des plus de 130 candidats peut actuellement être acheté dans le commerce. Cependant, avec quelques références supplémentaires pour chacune des classes biosynthétiques; l' accès aux bases de données bibliographiques spécifiant les composés précédemment trouvé dans les espèces végétales (par exemple, Fahey et al 22.); connaissances de base des principes chromatographiques, tels que la logique de la série éluotropique (par exemple, pour un nombre croissant de Cs sur la chaîne latérale en les composés aliphatiques, les figures 3 et 4); et la validation des échantillons individuels sur LC-MS 19 ou glucosinolates isolés sur RMN 23, on peut facilement surmonter cette limitation. La plupart des protocoles pour glucosinolates analyses utiliser des courbes de référence internes( Par exemple, une certaine concentration pour l'extraction de la sinigrine ou sinalbin à l'extraction par solvant 16, 17, 19). Principalement, les courbes de référence internes sont plus appropriées pour corriger les erreurs individuelles de traitement des échantillons et donc théoriquement obtenir une plus grande précision. Malgré cet avantage, nous préférons utiliser une courbe de référence externe en cinq points, comme nous analysons souvent différentes espèces sauvages, dont certains contiennent des niveaux élevés de sinigrine (par exemple, Brassica nigra 24) ou sinalbin (par exemple, Sinapis alba 25), le deux références glucosinolates pour lesquelles les facteurs de réponse sont disponibles. En outre, l'ajout de normes internes à chacun des échantillons augmente le coût des analyses, en tant que normes de référence en glucosinolates de haute qualité sont en général assez coûteux.
En conclusion, malgré les étapes qui prennent du temps, ce protocolefournit une méthode simple et accessible à extraire et à quantifier les glucosinolates dans des échantillons de plantes. Cependant, il est important de considérer que la teneur en glucosinolates eux – mêmes ne sont qu'une indication de l'activité biologique potentielle, vu que la nécessité de réagir avec la myrosinase, et les variations dans les produits de la réaction peuvent provenir d'une seule glucosinolates 11. des essais de validation doivent être effectués pour confirmer la pertinence biologique.
The authors have nothing to disclose.
NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University Tübingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).
Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20,864,320 | |
Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
HCL | VWR | 1,090,571,000 | |
Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
(−)-Sinigrin hydrate from horseradish |
Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
Ethanol | VWR | 20,816,298 | |
Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
Glass /wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
2 mL reaction tubes | VWR | 211-2606 | |
Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
Acetonitril super gradient grade | VWR | 83,639,320 | |
Water bath | VWR | 462-5112 | |
Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
Flask 1000 mL | VWR | 215-1595 | |
Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |