Summary

Herstellung von nichtmenschlichen Primaten Hirngewebe für die Pre-Einbettung Immunhistochemie und Elektronenmikroskopie

Published: April 03, 2017
doi:

Summary

Hier bieten wir eine einfache, kostengünstige und zeitsparendes Protokoll zu chemisch fixieren Primaten Hirngewebe mit Acrolein Fixiermittel, so dass für die Langzeitarchivierung, die kompatibel mit vorge Einbettung Immunhistochemie für die Transmissionselektronenmikroskopie.

Abstract

Trotz aller technologischen Fortschritte bei der Lichtmikroskopie Niveau bleibt Elektronenmikroskopie das einzige Werkzeug in den Neurowissenschaften zu untersuchen und zu charakterisieren, ultrastrukturelle und morphologische Details von Neuronen, wie synaptische Kontakte. Gute Erhaltung von Hirngewebe für die Elektronenmikroskopie kann durch strenge Kryo-Fixierung Verfahren erhalten werden, aber diese Techniken sind ziemlich teuer und begrenzen die Verwendung von Immunmarkierung, die von entscheidender Bedeutung ist, um die Konnektivität von identifizierten neuronalen Systemen zu verstehen. Gefriersubstitution Verfahren wurden die Verbindung von Kryo-Fixierung mit Immunmarkierung zu ermöglichen, entwickelt. Allerdings stützt sich die Reproduzierbarkeit dieser methodischen Ansätze in der Regel auf teure Gefriergeräte. Darüber hinaus wird mit dieser Technik zuverlässige Ergebnisse zu erzielen ist sehr zeitraubend und Geschick schwer. Somit bleibt das traditionelle chemisch fixierte Gehirn, insbesondere Acrolein Fixiermittel, eine zeiteffiziente und kostengünstige Methode Elektron zu kombinierenMikroskopie mit Immunhistochemie. Hier bieten wir ein zuverlässiges experimentelles Protokoll unter Verwendung von chemischen Acrolein Fixierung, die zur Erhaltung der Primaten Hirngewebe führt und ist kompatibel mit Pre-Einbettung Immunhistochemie und Transmissions-Elektronen-mikroskopische Untersuchung.

Introduction

Lichtmikroskopie, einschließlich konfokale und Zwei-Photonen – Mikroskopie, hat sich als ein wirksames Instrument zur in vivo neuronalen Prozesse zu studieren, unter anderem 1, 2. Obwohl die typische räumliche Auflösung bei der Lichtmikroskopische (LM) Ebene ungefähr 200 nm, die jüngsten technologische Fortschritte sind verschiedene Lichtquellen, wie beispielsweise extremer Ultraviolett- und weiche Röntgenmikroskopie, hat insbesondere diese Auflösung auf eine fast 10 nm räumlichen Auflösung erhöht 3 , 4, 5. Weitere technologische Fortschritte in der bildgebenden Magnetresonanz – Bildgebung umfassen mit der Histologie kombiniert und bieten ein neues Verfahren zur in vivo , die Dicke der Myelinscheide Messen eines Parameters, der traditionell meßbaren nur an der Elektronenmikroskopische (EM) Stufe 6, 7 war. Although diese Fortschritte bei der LM-Ebene ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Untersuchung lebende Prozesse liefern, um eine Detailansicht und Charakterisierung von Strukturen, wie synaptische Kontakte kann nur mit EM erreicht werden, die eine Auflösung bietet, die 0,5 nm erreichen kann. Allerdings Beobachtung bei der EM-Ebene erfordert die Proben in gewisser Weise tot und verändert zu werden, mit chemischen Fixateure und Entwässerungsverfahren, um die Zytoarchitektur zu bewahren. Somit können biologische Proben bei hoher Auflösung der Prüfung herausfordernd aufgrund von Strahlungsschäden des Elektronenstrahls, geringem Kontrast, strukturelle Abweichungen von Membranen oder auch das Vorhandensein von Artefakten , die nach der Dehydratisierung und epoxy auftreten können Einbettung 8, 9, 10.

Die Erhaltung Proben in ihrer nativen Form für die Strukturanalyse kann mit „Cryo EM verglastem Sections“ oder CEMOVIS, mit schneidendem Ansatz erreicht werden, dassbeinhaltet schnell einfrieren und die Probe in Eis glasiger Einbettungs und die Abschnitte unter der EM bei einer kryogenen Temperatur 11, 12 zu untersuchen. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung von Proben , während sie noch fester und vollhydratisierte sind, so dass Artefakte , die durch Austrocknung Beseitigung verarbeitet 13. Jedoch beinhaltet dieses Verfahren zusätzliche Vorrichtungen für Kryo-Ultramikrotomie, sowie zusätzliche Geräte auf dem Standard-EM, um diese Beobachtung bei sehr niedrigen Temperaturen zu ermöglichen, was erhebliche Mehrkosten erzeugen. Darüber hinaus schließt die CEMOVIS Ansatz die Verwendung von Techniken Immunmarkierung, da Antikörper in der Regel bei RT inkubiert werden müssen. Alternativ ist es möglich, ultrastrukturelle Analyse mit immunhistochemischen Verfahren zu kombinieren, indem eine Gefriert Substitution Ansatz, bei dem Kryo-fixierten Proben langsam aufgetaut werden, während in Cryo-Schutzchemikalien immerged und sind then in Spezialharze eingebettet, wie Lowicryls. Post-Einbettung Immunmarkierung kann dann auf einem solchen Material 12 durchgeführt werden. Allerdings Gefriersubstitution und Kryo-Fixierung Techniken sind zeitaufwendig. Sie erfordern die Installation zusätzlicher Ausrüstung und erfordern noch Proben zu organischem Lösungsmittel und chemische Fixiermittel ausgesetzt werden, die die Zytoarchitektur verändern können, trotz der Verwendung einer niedrigen Temperatur 14, 15. Daher trotz aller technologischen Fortschritte sowohl bei dem LM und EM – Ebene, chemische Fixierung von Hirngeweben, insbesondere Acrolein, bleibt eine kostengünstige und zeitsparende Methode zu kombinieren Immunhistochemie mit EM 16.

In den letzten Jahrzehnten wurden viele Versuche unternommen, eine Mischung von Aldehyden zu finden, das die beste Gewebeerhaltung bieten. Vor den 1960er Jahren die einzige Fixiermittel Chemikalie, die akzeptable Ergebnisse für EM gab, war Osmiumtetroxid. Allerdings ist Osmiumtetroxid sehr giftig und teuer, ihre Verwendung durch das Gefäßsystem ausschließen Organe wie das Gehirn zu fixieren. Acrolein wurde in den späten 1950er Jahren als ein zuverlässiges Verfahren für die Tiergewebekonservierung geeignet für EM Beobachtung von Zellstrukturen 17 eingeführt. Es durchdringt die tiefen Gewebe und reagiert schneller als anderer Aldehyde , wenn zur Fixierung durch Eintauchen verwendet , und ermöglicht eine gute Konservierung zytoplasmatischer Komponenten mit minimaler Schrumpfung des Gewebes 17. Ein solches Merkmal ergibt Fixierung acrolein einen klaren Vorteil gegenüber anderen Aldehyden in frischem Gewebe bei der Verwendung, durch eine genauere Lokalisierung von lebenden molekulare Verbindungen ermöglichen, wie Enzyme und andere Proteine , 18. Tatsächlich hat es sich als einfache, effiziente und kostengünstige Methode der Fixierung für Visualisierung an der EM-Ebene in vielen Arten, darunter Amphibien und Nagetiere, wie sie effizient stabili im Laufe der Jahre validiertZES Peptide und Proteine, behalten Antigenität und liefern relativ intakt Ultrastruktur , wenn 16 in Kombination mit einem anderen Aldehyd Fixativ verwendet, 18, 19, 20, 21. Protokolle für Acrolein Fixation in Nagetieren seitdem wurden umfassend, vor allem durch die Pickel – Gruppe, zur Umsetzung dual Immunomarkierung für EM 16, 22 standardisiert und verwendet. Einige Gruppen haben Acrolein Fixation in nicht-menschlichen Primaten – Hirngewebe 23 verwendet. Jedoch unser Wissen gibt es nur ein veröffentlichtes Protokoll effizient chemische Fixierung mit Acrolein in nicht-menschlichen Primaten beschreibt , die kompatibel sind mit EM Immunmarkierung 24.

In diesem Artikel stellen wir eine einfache und zuverlässige Methode effizient chemisch nicht-hum zu behebenein Primaten Gehirne mit Acrolein, so dass für eine potentiell langfristige Konservierung sowie vor Einbettungs Immunomarkierung und Übertragung EM Prüfung.

Protocol

Ethik-Statement: Alle Protokolle Tiere beteiligt sind, wurden durch die Comité de Protection des Animaux de l'Université Laval genehmigt und wurden in Übereinstimmung mit dem Canadian Council on Animal Care Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (Ed. 2) hergestellt. Das hier beschriebene Protokoll wurde von ca. 800 g für ausgewachsene Tiere optimiert. Die Volumina des Fixiermittel sollte nach dem Tiergröße angepasst werden. 1. Herstellung von Lösungen für die t…

Representative Results

In diesem Abschnitt präsentieren wir repräsentative Ergebnisse, die nach der Beobachtung erhalten wurden, bei der Übertragung EM-Ebene, von immunhistochemisch primate Hirngewebe chemisch mit einem Gemisch aus 3% Acrolein und 4% PFA fixiert. Wir erzielen gute Konservierung der Ultrastruktur, wie durch die relativ intakte Myelinscheide und der reinen Visualisierung von Doppelmembranen (2A) angedeutet ist . Synaptische Kontakte zusammen mit neuronaler Elemente aus der Mi…

Discussion

In diesem Artikel präsentieren wir ein zuverlässiges Protokoll für transkardiale Perfusion von nicht-menschlichen Primaten und Pre-Embedding Immunhistochemie geeignet für EM Probenprüfung. Obwohl typische Kryo-EM, wie CEMOVIS, eine gute Erhaltung des Gehirns Ultra bietet, schränkt sie auch die Verwendung von Immunhistochemie 12. Andere Techniken, einschließlich Kryo-Substitution und Tokuyaso Technik erlauben post-Einbettungs Immunhistochemie, aber diese Techniken sind teuer aufgrund zusät…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde von den Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC, 401848-2011 zu MP) unterstützt. MP erhielt eine Karriere Auszeichnung vom Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S). LE war der Empfänger einer Promotionsstipendium aus dem FRQ-S (FRQ-S 14D 29441). Wir danken Marie-Josée Wallman für technische Unterstützung.

Materials

Dibasic anhydrous sodium phosphate (Na2HPO4) Fisher scientific S374-500
Monobasic monohydrate sodium phosphate (NaH2PO4.H2O) EM Science SX0710-1
Sodium chloride (NaCl) Fisher scientific S271-3
Hydroxymethyl aminomethane (THAM) Fisher scientific T370-500
HCl  EMD HX0603-3 1N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate potection.
NaOH EMD SX0590-1 5N dilution. Product is corrosive. Use with appropriate protection.
Paraformaldehyde Sigma P6148 4% dilution. Product is highly volatile in its powder form and highly toxic. Use with caution under a venting hood with appropriate protection.
Acrolein (90%) sigma 110221 3% dilution. Product is highly toxic. Use under a venting hood with appropriate protection.
Autopsy venting table Mopec CE400
Electronic perfusion pump cole parmer masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion) terumo  NN-1838R 18G 1 1/2
Needle terumo  NN-2713R 21G 1/2
Ketamine 20 mg/kg
Xylazine 4 mg/kg
Acepromazine 0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades Feather           lance 201011           J9913 No.22 for surgery and    No. 11 for EM
Surgical scissors
Rongeurs
Vibratome Leica VT 1200S Calibrate blade before each use, when the device allows it
Vibratome razor blade Gillette GIN 642107
Glycerol Fisher scientific G33-4 30% dilution
Ethylene glycol Fisher scientific E178-4 30% dilution
Sodium borohydride (NaBH4) sigma S-9125
Normal horse serum Jackson immunoResearch Laboratories 008-000-121 2% dilution
Cold-fish gelatin Aurion 900.033 0.5% dilution. Original product is concentrated at 40%
Primary antibody, SERT Santa Cruz biotechnology SC-1458 1/500 dilution
Primary antibody, ChAT Chemicon (Millipore) AB144P 1/25 dilution
Primary antibody, TH ImmunoStar 22941 1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, goat Vector laboratories BA-9500 1/1000 dilution
Biotinylated secondary antibody, mouse Vector laboratories BA-2000 1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit Vector laboratories PK6100 8.8 µL/mL of A and B each
3'3 diaminobenzidine (DAB) Sigma D5637 0,05% dilution. Product is highly volatile in its powder form and toxic. Do not throw waste in the sink.
Peroxide (H2O2) 30% Fisher scientific H-323 0,005% dilution
Osmium tetroxide (OsO4) Electron microscopic science 2% 19152           4% 19150              Original solution can be either 2% ou 4%. Keep attention to which one is used to calculate the final 1% dilution. Product is very sensitive to light. Osmium is highly toxic. Use only under a venting hood with appropriate protection.
Durcupan water-repellent epoxy resin sigma A: M epoxy resin (44611)                B: hardener 964 (44612)                C: accelerator 960 (DY 060)  (44613)               D: plasticizer (44614)  Polymerize 48h at 58 °C before throwing in waste.
Alumium cups Electron microscopic science 70048-01
Ethanol commercial alcohols 1019C Dilute in distilled water with appropriate concentration
Propylene oxide Electron microscopic science 20401 Organic solvent. Highly volatile and toxic. Use under a venting hood.
Non-coated medium glass slides brain research laboratories 3875-FR Grease surface with mineral oil
Plastic film (Aclar embedding film) Electron microscopic science 50425-25 Grease surface with mineral oil
Ultramicrotome Leica UC7 EM UC7
Diamond trimming tool (ultratrim) Diatome  UT 1081 Can use glass knife alternatively
Ultra 45° Diatome Diamond knife Diatome  MC13437 equipped with a boat
Xylenes Fisher scientific X5SK-4
150-mesh copper grids Electron microscopic science G150-cu
grid-box Electron microscopic science 71138 Can store up to 100 grids
Sodium citrate Anachemia 81983
Lead nitrate sigma L-6258 Make a stock solution of lead citrate made of 1.33 g of lead nitrate and 1.76g of sodium citrate diluted in 42 mL of pre-boiled and cooled distilled water to which 8 mL of 1N NaOH are added after the conversion from lead nitrate to lead citrate is complete. pH should be approximately 12. Store solution in a hermetic plastic bottle and protect from light.
Syringe terumo  SS-05L 5 mL
Syringe filter corning 431222 0.2 µm
Absorbing paper (bibulous paper) Electron microscopic science 70086-1
Parafilm Laboratory film PM-999
Mineral oil Sigma M5904

Referências

  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005 (2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S., Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008 (2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

Play Video

Citar este artigo
Eid, L., Parent, M. Preparation of Non-human Primate Brain Tissue for Pre-embedding Immunohistochemistry and Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (122), e55397, doi:10.3791/55397 (2017).

View Video