De bereiding van niet-menselijke primaten Brain Tissue voor Pre-embedding immunohistochemie en elektronenmicroscopie

Licht microscopie, inclusief confocale en twee-foton microscopie, heeft zich bewezen als een efficiënt instrument voor het bestuderen van in vivo neuronale processen, onder andere ^{1, 2} zijn. Hoewel de typische ruimtelijke resolutie in het lichtmicroscopische (LM) niveau ongeveer 200 nm, recente technologische ontwikkelingen met verschillende lichtbronnen, zoals extreme ultraviolet en zachte röntgenstraling microscopie, zijn aanzienlijk gestegen het verkrijgen van een nagenoeg 10 nm ruimtelijke resolutie ^{3 , 4, 5.} Andere technologische vooruitgang in de beeldvorming omvatten gecombineerde magnetische resonantie met histologie en een nieuwe werkwijze voor het meten van de dikte van de myelineschede in vivo, een parameter die traditioneel meetbare pas ter Elektronenmicroscopie (EM) niveau ^{6, 7.} although deze voorschotten op de LM niveau bieden een uitstekend hulpmiddel voor het bestuderen van het leven processen, een gedetailleerde weergave en karakterisering van structuren, zoals synaptische contacten, kan alleen worden bereikt met EM, dat een resolutie die 0,5 nm kan bereiken biedt. Echter, observatie op de EM niveau vraagt ​​de monsters doden en veranderd te zijn in sommige opzichten, met chemische fixatieven en uitdroging processen, met het oog op de cytoarchitecture behouden. Aldus onderzoeken biologische monsters met hoge resolutie kan een uitdaging zijn door schade straling van de elektronenstraal laag contrast, structurele afwijkingen van membranen, of zelfs de aanwezigheid van artefacten die na dehydratatie en inbedden epoxy ^{8, 9, 10} kan optreden.

Behoud specimens in hun natieve vorm structurele analyse kan worden bereikt door "Cryo EM verglaasd afdelingen" of CEMOVIS, een snijden benaderinggaat snel invriezen en verankeren het monster in glasachtige ijs en onderzoeken van de gedeelten onder de EM bij een cryogene temperatuur ^{11, 12.} Deze procedure maakt het mogelijk voor het onderzoek van monsters, terwijl ze nog steeds solide en volledig gehydrateerd, zodat het niet langer artefacten veroorzaakt door uitdroging verwerkt ^13. Deze werkwijze brengt extra inrichtingen voor cryo-ultramicrotomie, evenals extra apparatuur op de standaard EM, teneinde deze waarneming bij zeer lage temperaturen, hetgeen aanzienlijke meerkosten genereren mogelijk. Bovendien, de CEMOVIS benadering sluit het gebruik van immunokleuring technieken, omdat antilichamen gewoonlijk worden geïncubeerd bij KT. Als alternatief is het mogelijk ultrastructurele analyse immunohistochemische procedures te combineren door een vries-substitutiebenadering, waarbij cryo-vaste preparaten langzaam ontdooid terwijl ondergedompeld in cryo-beschermende chemicaliën en zijn Then ingebed in gespecialiseerde harsen, zoals Lowicryls. Post-inbedding immuunlabeling kan vervolgens worden uitgevoerd op dergelijk materiaal ^12. Echter, vries-substitutie en cryo-fixatie technieken zijn tijdrovend. Ze vereisen de installatie van extra apparatuur en moeten nog monsters worden blootgesteld aan organische oplosmiddelen en chemische fixatief dat cytoarchitecture kan veranderen, ondanks het gebruik van een lage temperatuur ^{14, 15.} Vandaar dat ondanks alle technologische vooruitgang zowel op LM en EM niveau chemische fixatie van hersenweefsel, met name acroleïne, blijft een goedkope en tijdbesparende werkwijze voor immunohistochemie combineren met EM ^16.

In de afgelopen decennia zijn veel pogingen gedaan om een ​​mengsel van aldehyden die de beste weefsel behoud te bieden te vinden. Voor de jaren 1960, de enige chemische fixeermiddel dat aanvaardbare resultaten voor EM gaf was osmiumtetroxide. Echter, osmiumtetroxide is zeer giftig en duur, zich verzet tegen het gebruik door het vaatstelsel naar organen zoals de hersenen vast. Acroleïne werd geïntroduceerd in de late jaren 1950 als betrouwbare methode voor dierlijk weefsel behoud geschikt voor EM waarneming van cellulaire structuren ^17. Penetreert het weefsel dieper en sneller reageert dan andere aldehyden gebruikt worden voor fixatie door onderdompeling en zorgt voor een goede conservering van cytoplasmatische componenten met minimale krimp van het weefsel ^17. Een dergelijk kenmerk geeft acroleïne fixatie een duidelijk voordeel boven andere aldehyden bij gebruik in vers weefsel, doordat een nauwkeurigere lokalisatie van levende moleculaire verbindingen, zoals enzymen en andere eiwitten ^18. Inderdaad, het is gevalideerd door de jaren als een eenvoudige, efficiënte en goedkope werkwijze voor fixatie voor visualisatie op EM niveau in vele soorten, waaronder amfibieën en knaagdieren, zoals het efficiënt StabiliZes peptiden en eiwitten, antigeniciteit behouden en verschaft relatief intact ultrastructuur bij gebruik in combinatie met een ander aldehyde fixeermiddel ^{16, 18, 19, 20, 21.} Protocollen voor acroleïne fixatie in knaagdieren zijn sindsdien gestandaardiseerd en veel gebruikt, met name door Pickel groep dual immunokleuring inrichting voor EM ^{16, 22.} Enkele groepen acroleïne fixatie gebruikt in hersenen van primaten niet-humaan weefsel ^23. Echter, voor zover wij weten, is er slechts één gepubliceerde protocol efficiënter beschrijven chemische fixatie met acroleïne bij niet-menselijke primaten die compatibel is met EM immunokleuring ²⁴ is.

In dit artikel geven we een gemakkelijke en betrouwbare methode om efficiënt chemisch fixeren non-humeen primaat hersenen met acroleïne, waardoor een potentieel langdurige conservering met pre-inbedding immunokleuring en transmissie EM onderzoek.