Вскрытие Личинки данио гонадная ткани

Основным фактором , определяющим женского пола в диком данио хромосоме 4 теряется или изменяется в одомашненных данио (например , общие штаммы лаборатории) ^1. Вместо этого они имеют полигенную систему определения пола сопровождается экологическими факторами, такие как температура, гипоксия, наличие пищи и плотность населения. Детальные механизмы развития данио пола до конца не изучены. Фундаментальные вопросы , такие как , когда происходит данио определение пола, что основной сигнал определения пола (ы) является / являются, и какие гены регулируют первый шаг преобразования гонад остаются не заполнено ^{2, 3.}

В процессе развития данио пола, несколько важных этапов были признаны. На ранней стадии развития, начиная с 4 часов после оплодотворения (ч после оплодотворения) эмбриональные-клетки (ПКА) претерпевают спецификации, переход к генитальному хребту ипролиферация. PGC число и взаимные взаимодействия между зародышевыми клетками и соматическими клетками имеют важное значение для дифференциации гонад ^4. В 13 денье (дней после оплодотворения), гонады находятся в недифференцированной стадии. К 17 денье, гонады развиваются в два раза потенциальных яичников у обоих будущих самок и самцов. Апоптоз-зависимый переход от яичника к семеннику начинается с 21 до 25 дения и может продолжаться в течение нескольких недель. К 35 денье, пол гонады была определена и секс конкретного производства гамет ведется в обоих яичников и семенников ^{5, 6, 7.}

На сегодняшний день, были предложены различные гены и механизмы определения пола кандидатов. Протеомика и анализ транскриптомного выделили множество генов с половым диморфизмом экспрессией и эти гены были использованы для изучения половой дифференциации в данио ^8, </sup> ^{9, 10.} Например, в личиночной данио, ген cyp19a1a специфически экспрессируется в яичниках , но не в семенниках ^{11, 12.} Кроме того, ген АМГА слабо выражен в овариальных фолликулах зернистых клеток, но сильно в клетках Сертоли семенников ^13. В противоположность этому , ген васа непрерывно выражается в зародышевых клетках как женского и мужского данио, что делает его подходящим маркером гонад ^{14, 15.}

Исследование гонадных уровней экспрессии генов важно понять молекулярный механизм определения пола и дифференциации , особенно в би-потенциал яичников стадии ^{3, 9.} Однако небольшой размер личиночной данио и, соответственно, мелких гонад осложнить изоляцию gonadaл ткани для дальнейшего молекулярного анализа. Предыдущие исследования использовали расчлененные весь регион магистрального между opercula и анальной порой ^16. Этот препарат, хотя, содержащие гонады, состоит из нескольких тканей и органов. Альтернативно, трансгенные животные с выражением GFP гонад специфические , такие как Vasa: были использованы EGFP для изоляции гонадной ткани с помощью флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS) и лазерного захвата микро-рассечение ^{17, 18.} Но их широкое применение ограничено. Здесь мы опишем простую процедуру, чтобы изолировать гонад ткани от личиночной данио в 17 денье и 25 денье. Мы демонстрируем позицию гонад по отношению к другим органам и изолировать морфологический интактные гонады от окружающих тканей. Мы также показываем , гонады специфических генов , такие как Vasa и cyp19a1a высоко выражены в изолированных гонадах по сравнению с магистральной тканью через количественный ПЦР (КПЦР) анализа. Настоящий протокол позволяет идентификации, выделения, очистки РНК и амплификации специфических генов гонад из личиночной данио, тем самым позволяя последующего молекулярного анализа гонадной ткани ^19.