La dissezione del larvale Zebrafish gonadica Tissue

Il principale determinante del sesso femminile nel selvaggio cromosoma zebrafish 4 è perso o modificato nel zebrafish addomesticato (vale a dire i ceppi più comuni di laboratorio) ^1. Al contrario, hanno un sistema di determinazione del sesso poligenica accompagnato da fattori ambientali come la temperatura, l'ipossia, la disponibilità di cibo e la densità di popolazione. I meccanismi dettagliati dello sviluppo sessuale zebrafish non sono pienamente compresi. Domande fondamentali come quando si verifica determinazione del sesso zebrafish, ciò che il segnale determinazione sessuale primaria (s) è / sono, e quali geni regolano il primo passo di trasformazione gonadi restano da risolvere ^{2, 3.}

Nel processo di sviluppo sessuale zebrafish, più tappe importanti sono state riconosciute. Nella fase iniziale di sviluppo, a partire dal 4 HPF (ore dopo la fecondazione) cellule germinali primordiali (PGC) sottoporsi specifica, migrazione cresta genitale eproliferazione. Numeri PGC e interazioni reciproche tra cellule germinali e cellule somatiche sono importanti per gonadi differenziazione ^4. A 13 dpf (giorni dopo la fecondazione), le gonadi sono in fase indifferenziata. Con 17 DPF, le gonadi si sviluppano in ovaie bi-potenziali in entrambi i maschi e femmine futuri. La transizione apoptosi dipendente da ovaio al testicolo inizio alle 21 a 25 dpf e può continuare per diverse settimane. Da 35 dpf, il sesso della gonade è stata determinata e produzione di gameti sesso-specifico è in corso in entrambe le ovaie e testicoli ^{5, 6, 7.}

Fino ad oggi, sono stati proposti diversi geni candidati ei meccanismi di determinazione del sesso. Proteomica e analisi trascrittomica hanno isolato molti geni con espressione dimorfismo sessuale e questi geni sono stati utilizzati per studiare la differenziazione del sesso in zebrafish ^8, </sup> ^{9, 10.} Ad esempio, in zebrafish larvale, il gene cyp19a1a è specificamente espresso nelle ovaie, ma non nel testicolo ^{11, 12.} Inoltre, gene amh è debolmente espressa nelle cellule follicolo granulosa ovarica, ma fortemente nei testicoli cellule di Sertoli ^13. Al contrario, gene vasa continuamente espresso nelle cellule germinali sia zebrafish maschile e femminile, che lo rendono adatto marcatore gonadi ^{14, 15.}

Indagare gonadici livelli di espressione genica è fondamentale per capire il meccanismo molecolare di determinazione del sesso e la differenziazione soprattutto nella fase ovaie bi-potenziale ^{3, 9.} Tuttavia, le piccole dimensioni delle zebrafish larvale e corrispondentemente piccole gonadi complicare l'isolamento di gonadal tessuti per ulteriori analisi molecolari. Precedenti studi utilizzati sezionati tutta la regione del tronco tra l'opercoli e pori anale ^16. Questa preparazione, anche se contenenti gonadi, costituito da più tessuti e organi. In alternativa, gli animali transgenici con espressione GFP specifico gonade come vasa: EGFP sono stati usati per l'isolamento tessuto gonadico mediante fluorescenza delle cellule attivate (FACS) e la cattura laser micro-dissezione ^{17, 18.} Ma la loro applicazione diffusa è limitata. Qui, descriviamo una semplice procedura per isolare il tessuto gonadico da zebrafish larvale a 17 dpf e 25 dpf. Dimostriamo la posizione delle gonadi rispetto ad altri organi e isolare le gonadi morfologicamente intatte dai tessuti circostanti. Mostriamo ulteriormente i geni specifici gonade come vasa e cyp19a1a sono altamente espresso nelle gonadi isolate rispetto al tessuto tronco tramite PCR quantitativa (qPCR) analisi. Il presente protocollo permette l'identificazione, l'isolamento, la purificazione dell'RNA e l'amplificazione di geni specifici gonadici da zebrafish larvale, consentendo così successiva analisi molecolare del tessuto gonadica ^19.