Summary

In vitro-differentiering av mänskliga pluripotenta stamceller till trophoblastic celler

Published: March 16, 2017
doi:

Summary

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Abstract

Moderkakan är det första organ som utvecklas under embryogenes och krävs för överlevnad det växande embryot. Moderkakan består av diverse trofoblastiska celler som skiljer från de extra embryonala trophectoderm celler i preimplantatorisk blastocyst. Som sådan är vår förståelse av de tidiga differentierings händelserna i human placenta begränsad på grund av etiska och juridiska restriktioner för isolering och manipulering av mänskliga embryogenes. Humana pluripotenta stamceller (hPSCs) är ett robust modellsystem för undersökning av människans utveckling och kan också differentieras in vitro till trofoblastiska celler som uttrycker markörer för de olika trofoblasten celltyper. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för differentiering hPSCs i trofoblastiska celler med användning av benmorfogent protein 4 och hämmare av Aktivin / Nodal signalvägar. Detta protokoll genererar olika trofoblasten celltyper som kan transfekteras med siRNAför att undersöka förlust av funktions fenotyper eller kan infekteras med patogener. Dessutom kan hPSCs genetiskt modifierade och sedan differentieras till trofoblasten stamceller för vinst-of-funktion analyser. Detta in vitro differentiering metod för att generera humana trofoblaster utgående från hPSCs i vinner de etiska och juridiska restriktioner för att arbeta med mänskliga embryon början, och detta system kan användas för en mängd olika tillämpningar, inklusive läkemedelsforskning och stamcellsforskning.

Introduction

Moderkakan krävs för tillväxt och överlevnad av fostret under graviditeten och underlättar utbytet av gaser, näringsämnen, avfallsprodukter och hormoner mellan moderns och fostrets cirkulation. Det första organet bildas under däggdjursembryogenes är moderkakan, som börjar att utveckla 6-7 dagar efter befruktning hos människor och 3,5-4,5 dagar hos möss 1, 2, 3, 4. Trofoblastiska celler är de viktigaste cellerna i moderkakan, och dessa celler representerar en av de tidigaste härstamning differentiering händelserna i däggdjursembryo. De uppstår från de yttre extra embryonala trophectoderm celler i preimplantatorisk blastocyst. Vår kunskap om de tidiga stadierna av placenta utveckling begränsas av etiska och logistiska begränsningar för modellering människans tidiga utveckling.

Under embryonala implantation, trofoblasterinvadera moderns epitel och differentierar till specialiserade progenitorceller 5. Cytotrofoblaster (CTBs) är mononukleära, odifferentierade stamceller som smälter och differentieras till syncytiotrophoblasts (Syns) och extravillous invasiva trofoblaster (EVTs), vilket ankare moderkakan i livmodern. Syns är flerkärniga, terminalt differentierade celler som syntetiserar hormoner som är nödvändiga för att upprätthålla graviditet. De tidiga differentieringshändelser som genererar EVTs och Syns är avgörande för placenta bildning, som försämringar i trofoblastiska celler resulterar i missfall, havandeskapsförgiftning, och intrauterin tillväxthämning 1. De typer av trofoblasten cellinjer mänskliga som har utvecklats innefattar odödlig CTBs och choriocarcinomas, som producerar moderkakan hormoner och visa invasiva egenskaper 6. Primära trofoblastiska celler från humana första trimestern placentor kan isoleras, men cellerna snabbt differentiate och stoppa prolifererande in vitro. Viktigt är transformerade och primära cellinjer har olika genuttrycksprofilerna, vilket tyder på att tumörogena och förevigade trofoblasten cellinjer inte exakt kan representera primär trofoblaster 7. Dessutom är det osannolikt att likna placental trofoblasten stamceller stamceller eftersom de härrör från senare steg först genom tredje trimestern dessa linjer.

Det finns ett behov av en robust in vitro-kultur system för tidigt skede mänskliga trofoblaster för att studera de tidiga händelserna i placenta bildning och funktion. Humana embryonala stamceller (hESCs), som delar egenskaper med den inre cellmassan av preimplantationsembryot, används ofta för att modellera människans tidiga utveckling, inklusive bildandet av den tidiga moderkakan. Både mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs) och hESCs kan delas in i trofoblaster in vitro med hjälp av Bone Morphogenic protein 4 (BMP4) 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15. Denna omvandling av pluripotenta celler till trofoblastiska celler med användning av BMP4 är specifik för humana celler och används ofta för att studera utvecklingen av den tidiga human placenta, eftersom den inte kräver tillgång till tidiga mänskliga embryon 9, 16. Nyligen upptäcktes det att tillsatsen av inhibitorerna A83-01 (A) och PD173074 (P), som blockerar de Smad2 / 3 och MEK1 / 2 signalvägar, ökar effektiviteten i hPSC differentiering till trophectoderm liknande progenitorer, huvudsakligen Syns och EVTs, utan omfattande generationen av mesoderm, endoderm, eller ektoderm celler 9, 17 </sup>. Med hjälp av dessa mediumförhållanden, hESCs differentieras för 12 dagar har liknande genuttrycksprofilerna som trophectoderm celler som isolerats från blastocyst skede embryon mänskliga och utsöndrar olika placenta specifik tillväxthormoner, stödja giltigheten av detta in vitro-modellsystem 9, 11. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för differentiering in vitro av hPSCs i humana trofoblasten stamceller med hjälp av BMP4 / A / P odlingsmedium. Dessa villkor producerar rikliga mängder celler för en mängd olika tillämpningar, inklusive RNA-sekvensering, gen störningar med hjälp av siRNA, patogena infektioner, och genetisk modifiering med hjälp av lipofektion-medierad transfektion.

Protocol

OBS: För differentiering av antingen hESCs eller hiPSCs i trofoblasten stamceller, hPSCs odlas på mus embryonala fibroblaster (MEF) är över till feeder-fria förhållanden för två passager innan behandling differentiering med BMP4 / A / P. Detta förfarande eliminerar MEF kontamination av differentierade celler. Här presenterar vi ett protokoll för hESC differentiering och samma protokoll kan tillämpas på hiPSCs. 1. Kultur och återvinning av hESCs på Bestrålade mus Embryonala fibroblaster (MEF) (Förb…

Representative Results

Översikt över In vitro-differentiering av hPSCs Denna in vitro-differentieringsprotokoll börjar med odifferentierade hESCs odlas på MEFs som övergått i feeder-fria förhållanden för en passage (Figur 1A). Medan vi beskrev differentieringen av hESCs i detta protokoll använde vi detta protokoll för att framgångsrikt differentiera hiPSCs i trofoblastiska celler. Övergången till extrace…

Discussion

Vi presenterade de grundläggande stegen för att differentiera hESCs i trofoblasten stamceller. Detta protokoll har nyligen optimerats för att snabbt differentiera hESCs med tillsats av Aktivin / Nodal signalerings inhibitorer, vilket ökar differentiering till trofoblastiska celler och undvika alstringen av mesoderm stamceller, vilka typiskt observeras med BMP4 behandling ensam. Den BMP4 modellsystem gör det möjligt att undersöka de tidigaste stadierna av mänskligt trofoblasten härstamning specifikation och expa…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by a Pennsylvania Health Research Formula Fund.

Materials

DMEM/F12 Invitrogen 11330-057
Knock Out Serum Replacement Invitrogen 10828-028 This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAA Invitrogen 11140-050
FBS Invitrogen 16000-044
L-Glutamine Invitrogen 10828-028
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-155
2-Mercaptoethanol Sigma M-7522
B-FGF Millipore GF-003
DMEM Invitrogen 11965-118
Dispase Invitrogen 17105-041
Collagenase Type IV Invitrogen 17104-019
Rock inhibitor Y27632 Calbiochem 688000
Irradiated CF1 MEFs GlobalStem 6001G MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 um syringe filter Millipore SLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubator Heracell/VWR 89187-192 Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4 R&D Systems 314-BP-01M
A 83-01 R&D Systems 2939/10
PD173074 R&D Systems 3044/10
RNAiMax Invitrogen 13778150
Trizol ThermoFisher 15596026 Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9 Roche 6365779001
Matrigel Corning 356231 This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.

Referências

  1. Rugg-Gunn, P. J. Epigenetic features of the mouse trophoblast. Reproductive biomedicine online. 25 (1), 21-30 (2012).
  2. Rossant, J., Cross, J. C. Placental development: lessons from mouse mutants. Nature reviews. Genetics. 2 (7), 538-548 (2001).
  3. Hertig, A. T., Rock, J., Adams, E. C., Menkin, M. C. Thirty-four fertilized human ova, good, bad and indifferent, recovered from 210 women of known fertility; a study of biologic wastage in early human pregnancy. Pediatrics. 23 (1 Part 2), 202-211 (1959).
  4. Steptoe, P. C., Edwards, R. G., Purdy, J. M. Human blastocysts grown in culture. Nature. 229 (5280), 132-133 (1971).
  5. Delorme-Axford, E., Sadovsky, Y., Coyne, C. B. The placenta as a barrier to viral infections. Annual Review of Virology. 1, 133-146 (2014).
  6. Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular aspects of medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
  7. Bilban, M., et al. Identification of novel trophoblast invasion-related genes: heme oxygenase-1 controls motility via peroxisome proliferator-activated receptor gamma. Endocrinology. 150 (2), 1000-1013 (2009).
  8. Xu, R. H., et al. BMP4 initiates human embryonic stem cell differentiation to trophoblast. Nature biotechnology. 20 (12), 1261-1264 (2002).
  9. Amita, M., et al. Complete and unidirectional conversion of human embryonic stem cells to trophoblast by BMP4. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), E1212-E1221 (2013).
  10. Genbacev, O., et al. Establishment of human trophoblast progenitor cell lines from the chorion. Stem Cells. 29 (9), 1427-1436 (2011).
  11. Marchand, M., et al. Transcriptomic signature of trophoblast differentiation in a human embryonic stem cell model. Biology of reproduction. 84 (6), 1258-1271 (2011).
  12. Hyslop, L., et al. Downregulation of NANOG induces differentiation of human embryonic stem cells to extraembryonic lineages. Stem cells. 23 (8), 1035-1043 (2005).
  13. Harun, R., et al. Cytotrophoblast stem cell lines derived from human embryonic stem cells and their capacity to mimic invasive implantation events. Human reproduction. 21 (6), 1349-1358 (2006).
  14. Lichtner, B., Knaus, P., Lehrach, H., Adjaye, J. BMP10 as a potent inducer of trophoblast differentiation in human embryonic and induced pluripotent stem cells. Biomaterials. 34 (38), 9789-9802 (2013).
  15. Chen, Y., Wang, K., Chandramouli, G. V., Knott, J. G., Leach, R. Trophoblast lineage cells derived from human induced pluripotent stem cells. Biochemical and biophysical research communications. , (2013).
  16. Roberts, R. M., et al. Differentiation of trophoblast cells from human embryonic stem cells: to be or not to be?. Reproduction. 147 (5), D1-D12 (2014).
  17. Sarkar, P., et al. Activin/nodal signaling switches the terminal fate of human embryonic stem cell-derived trophoblasts. The Journal of biological chemistry. 290 (14), 8834-8848 (2015).
  18. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Mol Cell Biol. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  19. Penkala, I., et al. lncRHOXF1, a Long Noncoding RNA from the X Chromosome That Suppresses Viral Response Genes during Development of the Early Human Placenta. Molecular and cellular biology. 36 (12), 1764-1775 (2016).
  20. Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
  21. Bernardo, A. S., et al. BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell stem cell. 9 (2), 144-155 (2011).
  22. Zhang, P., et al. Short-term BMP-4 treatment initiates mesoderm induction in human embryonic stem cells. Blood. 111 (4), 1933-1941 (2008).
  23. Vallier, L., et al. Early cell fate decisions of human embryonic stem cells and mouse epiblast stem cells are controlled by the same signalling pathways. PloS one. 4 (6), e6082 (2009).
  24. Arman, E., Haffner-Krausz, R., Chen, Y., Heath, J. K., Lonai, P. Targeted disruption of fibroblast growth factor (FGF) receptor 2 suggests a role for FGF signaling in pregastrulation mammalian development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (9), 5082-5087 (1998).
  25. Yu, P., Pan, G., Yu, J., Thomson, J. A. FGF2 sustains NANOG and switches the outcome of BMP4-induced human embryonic stem cell differentiation. Cell stem cell. 8 (3), 326-334 (2011).
  26. Sudheer, S., Bhushan, R., Fauler, B., Lehrach, H., Adjaye, J. FGF inhibition directs BMP4-mediated differentiation of human embryonic stem cells to syncytiotrophoblast. Stem cells and development. 21 (16), 2987-3000 (2012).
  27. Bischof, P., Irminger-Finger, I. The human cytotrophoblastic cell, a mononuclear chameleon. The international journal of biochemistry & cell biology. 37 (1), 1-16 (2005).
  28. Cole, L. A. Hyperglycosylated hCG, a review. Placenta. 31 (8), 653-664 (2010).
  29. Apps, R., et al. Human leucocyte antigen (HLA) expression of primary trophoblast cells and placental cell lines, determined using single antigen beads to characterize allotype specificities of anti-HLA antibodies. Immunology. 127 (1), 26-39 (2009).

Play Video

Citar este artigo
Wang, J., Anguera, M. C. In Vitro Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Trophoblastic Cells. J. Vis. Exp. (121), e55268, doi:10.3791/55268 (2017).

View Video