Summary

Афалин (Tursiops truncatus) Дельфин сперматозоидов: сбор, криоконсервация и гетерологичных В экстракорпорального оплодотворения

Published: August 21, 2017
doi:

Summary

Здесь мы представляем протоколы, которые успешно использовались для сбора сперматозоидов Дельфин, криоконсервация и гетерологичных эко производительности с помощью бычьего ооцитов.

Abstract

Использование Дельфин Криоконсервированные сперматозоидов облегчает обмен генетического материала между водных парков и делает доступными для лаборатории для исследования для дальнейшего понимания воспроизводства морских млекопитающих сперматозоидов. Гетерологичных Эко, замена для гомологичных Эко, может служить средством для тестирования фертильности спермы потенциал; Изучение физиологии гамет и раннего развития эмбрионов; и чтобы избежать использования ценных Дельфин ооцитов, которые трудно получить. Здесь мы представляем протоколы, которые были успешно использованы для сбора и криоконсервировать Дельфин сперматозоидов. Коллекция спермы производится ручной стимуляции на подготовленных дельфинов. Криоконсервация осуществляется с помощью медиаприставки трис-желток яйца на основе с глицерином. Кроме того мы представляем протокол, который описывает гетерологичных ЭКО с использованием Дельфин сперматозоидов и говядину ооцитов и что проверяет гибридный характер полученный эмбрион с помощью ПЦР. Гетерологичных оплодотворение поднимает вопросы на оплодотворение и может использоваться в качестве инструмента для изучения физиологии гамет и раннего эмбрионального развития. Кроме того успех гетерологичных эко демонстрирует потенциал этой техники для тестирования Дельфин спермы подкормки потенциала, который заслуживает дальнейшего изучения.

Introduction

Вспомогательные репродуктивные технологии слабо развиты в диких животных, включая морских млекопитающих. Отсутствие чувствительных методов оценки спермы подкормка успех способствует медленного развития репродуктивных технологий в таких видов, как дельфин. Он не был до недавнего времени основные параметры семенных афалины (Tursiops truncatus) были сообщил1,2. Однако такие переменные, как подвижность и морфологии, хотя широко используется, дают ограниченную информацию о репродуктивной эффективности. Лучшим показателем качества спермы является оценка возможностей внесения удобрений.

Недавно наша группа используется метод для оценки Дельфин спермы подкормки потенциал путем оценки мужской pronuclear формирования и/или гибридных формирование эмбриона после гетерологичных ЭКО с использованием zona нетронутыми говядину ооцитов3. Использование Дельфин говядину гетерологичных эко имеет важные преимущества над гомологичных Эко, как он преодолевает трудности получения Дельфин ооцитов и облегчает использование систем испытанный в vitro говядину яйцеклетка созревания. Во избежание видов специфика гетерологичных оплодотворение обычно выполняется в отсутствие ZP. Хотя это позволяет для оценки способности отреагировали Акросома сперматозоидов предохранитель с vitelline мембраной, он повреждает оценки других функций, связанных с оплодотворения. Процедура, описанная использует zona нетронутыми ооцитов и позволяет оценку следующих параметров: спермы zona привязки и привязанности, проникновения, polyspermy, pronuclear формирования и гибридные расщепления эмбрионов.

Здесь мы представляем несколько протоколов для сбора семени, анализ основных спермы, замораживание сперматозоидов, а также оценки Дельфин спермы функциональность путем оценки мужской pronuclear и/или гибридных формирование эмбриона после гетерологичных ЭКО с использованием zona нетронутыми говядину ооцитов.

Protocol

этика заявление: все экспериментальные процедуры были рассмотрены и одобрены институциональный уход животных и использование Комитета Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (МИС). Все эксперименты были проведены в соответствии с руководство по уходу и использованию лабораторных жи?…

Representative Results

Все результаты, таблицы и цифры (1 и 2), представленные здесь, были воспроизведены с разрешением3. Дельфин сперматозоидов имеют высокую подвижность после замораживания и оттаивания Эякуляции ?…

Discussion

Для многих различных видов млекопитающих есть разнообразные преимущества использования деконсервированных спермы. К ним относятся возможность передачи ценный генетический материал, потенциал для распространения во всем мире, низкий риск загрязнения и возможность сохранения мужски…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

его работа финансировалась министерством экономики и конкурентоспособности (AGL2015-70140-R для D. Rizos), AGL2015-66145R A. Гутьеррес-Адан и J. F. Перес-Гутьеррес и Сенека фонд Мурсия (20040 Грант/ЗАРОДЫШЕЙ/16 до F. Гарсия-Васкес)

Materials

FERT-TALP medium Merck
TCM-199 Sigma M-4530
Hoechst 33342 Sigma B-2261
4-well dishes Nunc 176740
Density gradient BoviPure Nidacon International BP-100
Washing solution Boviwash Nidacon International BW-100
Magnesium chloride Promega A35 1H
Sterile water Mili Q sintesis A10 Millipore A35 1H
Buffer Tris Borate EDTA Sigma T4415
MB agarose Biotools 20.012
5X GoTaq flexi buffer Mili Q sintesis A10 Millipore M 890 A
MB agarose Biotools 20.012
Taq polymerase Promega
SafeView NBS Biologicals Ltd. M 890 A
Makler counting chamber Sefi Medical
Thoma chamber Hecht-Assistant
pHmeter MicropH 2000 Crison Instruments
Osmometer Advanced micro osmometer 3300 Norwood
Computer assisted sperm analysis system Projectes y Serveis R+D
Stereomicroscope MZ 95 Leica
Epifluorescent optics Eclipse Te300 Nikon
Confocal assistant 4.02 software Bio-Rad 3D analysis software
Confocal laser scanning microscopy Bio-Rad
Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) Gilson
Microcentrifuge tubes VWR
UV iluminator Bio-Rad
PCR Thermal cycler Primus 96 Plus MWG AG Biotech

Referências

  1. Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
  2. Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
  3. Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
  4. Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
  5. Robeck, T. R., O’brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
  6. Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
  7. Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
  8. Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
  9. Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
  10. Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
  11. Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
  12. Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
  13. Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).

Play Video

Citar este artigo
Sánchez-Calabuig, M. J., García-Vázquez, F. A., Laguna-Barraza, R., Barros-García, C., García-Parraga, D., Rizos, D., Gutiérrez Adan, A., Pérez-Gutíerrez, J. F. Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) Spermatozoa: Collection, Cryopreservation, and Heterologous In Vitro Fertilization. J. Vis. Exp. (126), e55237, doi:10.3791/55237 (2017).

View Video