Summary

"Acufection" ve Cilt Araştırmaları onun Uygulaması tarafından bir Ekonomik DNA Yerleştirme Sisteminin Geliştirilmesi

Published: April 19, 2017
doi:

Summary

Bu protokol Fare deride çıplak plazmid DNA eksprese etmek için uygun maliyetli bir alternatifidir. protokol genel amacı deri iltihabı, belirli bir genin işlevsel rolünü betimlemişlerdir cilt dokusuna immün ilişkili genleri sunmaktır.

Abstract

Deride bağışıklık yanıtının düzensizliği sayısız insan derisi bozuklukları ile ilişkilidir. deri dokusu, bağışıklık ile ilişkili genlerin doğrudan transferi insan hastalıklarının fare modellerinde deri inflamasyon, immün modülasyonunu araştırmak için ilginç bir yaklaşımdır. Burada fare deri çıplak DNA teslim ve transgen ifadesine yol açan düşük maliyetli bir protokol mevcut. Yöntem, aku delinmez aracılı DNA trans Fection belirten, "acufection" terimini almaktadır. acufection gerçekleştirmek için, fare deri önce fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde DNA ile aşılanmış ve daha sonra hücrelere DNA emme ve transfeksiyon kolaylaştırmak için akupunktur iğneleri bir paket ile hafifçe dürtülmüş. plazmid DNA muhtemelen keratinositler ve deride dentritik hücreler (DC'ler) ile alınır ve protein içine eksprese edilir. Iğneler bizatihi Mekanik prick zarar veya keratinosit aktivasyonunu uyarmadı. İfadetransfekte olmuş genlerin 2 gün acufection aşağıdaki transkripsiyonel ve translasyonel her iki düzeyde de deride tespit edildi ve 7 güne kadar sürmüştür. Bu acufection yöntemin geliştirilmesi için birincil amacı, IL-15, daha önce tanımlanmamış izoformu araştırmaktır. inflamasyonunu indüklemek amacıyla, deride eksprese edilir ve daha sonra bir Toll benzeri reseptör 7 (TLR7) agonisti, imikimod (IMQ) ile muamele, bu yöntem, kısmen silinmiş ekson 7 (IL-15ΔE7) bir alternatif olarak eklenmiş, IL-15 izoformunun edildi kullanılması. Acufection teslim deri IL-15ΔE7 IMQ bağlı deri iltihabı, keratinositlerin çoğalmasını, epidermal kalınlığı ve nötrofil bastırılır. Kutanöz enflamasyon düzenleyici mekanizmaların tanımlanması artan ilgi ile, protokol burada tarif edilen in vivo olarak DNA nakli için gen tabancası sistemi ya da mikro-için uygun maliyetli bir ve çok yönlü bir alternatif sağlar. Bu potansiyel olarak bir yeni fonksiyonunun keşif izin verebilirderide veya kutanöz hastalıklar için yeni tedavi araştırmak için gen.

Introduction

Cilt konak savunmasının ilk basamak olduğunu. Keratinositler (KCs), insanlarda ve farelerin derisinde başlıca hücre tipidir. Çevresel uyarılara (örneğin, güneş ışığı, oksijen, kimyasal ve patojenik invazyonu) yanıt olarak, KCs aktif ve IL-8, IL-6, IL-1a, IL-1 p, TNF-a gibi iltihap öncesi sitokinler ve kemokinlerin geniş bir yelpazeye üretirler α ve GM-CSF 1. Birlikte cilde bağışıklık hücrelerinin alınmasını tetikleyebilir. Ağır deri iltihabı sıklıkla akut ektopik kontakt dermatit, kronik bir T hücresi aracılı enflamasyonun (örneğin, alerjik kontak dermatit ve psoriasis) 2 dahil olmak üzere çok sayıda insan hastalıkları ile bağlantılıdır. KC aktivasyonunu inhibe ederek derideki inflamatuar öncesi yanıtları modüle deri iltihabı tedavi etmek için makul bir yaklaşımdır. Bu protokol geçici bağışıklık res incelemek amacıyla epidermiste bir sitokin gen ifade için yeni bir yaklaşım anlatılmaktadırderide böyle bir muameleye sonuçta ponse.

epidermis cildin en yüzeysel tabakası oluşturur. Bu tür cildin daha derin katmanları girmesini nükleik asitler ve patojenler olarak dış maddeleri tutmak fiziksel bir engel olarak görev yapar. Çeşitli iğnesiz teknikler epidermal DNA transferi, 3, 4 için kurulmuştur. Solüsyon içindeki DNA veya katyonik lipozomlar veya adenovirüs vektörleri ile bağlantılı doğrudan bu stratum corneum'un çıkarılması ya da reaktif tüylerini giderildikten ile muamele gibi teknikleri ile modifiye epidermise tatbik edilmiştir. Kornifiye epitel çıkarılması, DNA bağışıklık tepkilerini 5 indükleme keratinositler, Langerhans hücreleri ile epidermal bariyer ve etkileşim geçen kolaylaştırır. Bir geniş yüzey alanı, DNA transferi için mevcuttur ve bu yaklaşım iğneler dahil etmese de, ihtiyacı da dahil olmak dezavantajları vardırsıyrılmasıyla – (100 ug 10), cilt üzerinde sert tedavi ve DNA verme güçlendirici 6 olmayan bağışıklık kazandırılmış hayvanlarda bağışıklık tepkisini indüklemede tutarsız sonuçlar DNA'nın büyük miktarlarda. Deriye Çıplak DNA mikropartikül aracılı hücre için bağışıklık tepkisi 7, 8 indüklemek için yüksek verimli ve tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir. Elde tutulan bir gen tabancası basınçlı helyum hava akışı 9 yardımıyla büyüklüğü 2 um çaplı plazmid DNA ile kaplanmış altın partikülleri ile cildin hedef sitesi bombardıman için kullanılmıştır. Plazmit DNA, muhtemelen deri KCsand dendritik hücreler (DC) tarafından alınır ve protein yerel olarak ifade edilir veya DC'ler 10 ile lenf düğümleri taşınır. Gen tabancası sistemi basit ve sınırlı teknik deneyim, "DNA bul, hazırlanması ve teslim için maliyet gerektirse deizin "(yani altın tozlar, helyum gazı) ve gen tabancası için kendisi genel uygulamasını sınırlamıştır. deneyler farklı yerlerde yapılmaktadır Buna ek olarak, bir helyum gaz iletim sistemi için ihtiyaç gen tabancası taşıma kolaylığı sınırlar. mikro- tek bir enjeksiyon ve partikül bombardımanı 11'den daha gen transferinin bir yüksek verim elde etmek için ortaya konmuştur. mikro-parçacık boncuk kullanılmadan deriye DNA verilmesi için bir dövme silah kullanan 11. Salınımlı Bu yaklaşımı kullanarak, tüm cilt üzerine mikroiğneler muhtemeldir şirketinden aynı anda birden fazla hücrelere DNA transferi, böylece, hücre zarını, kazıma ve. Bununla birlikte, 0.254 mm çapında iğne ile enjeksiyon çok sayıda ilişkili ağrı bir dezavantajdır.

Burada in vivo DNA aktarımından için alternatif bir yaklaşım sunmaktadır. "Acufection" </strOng> Burada açıklanan protokol Fare deride plazmid DNA teslim etmek için ekonomik ve etkili bir yol sağlar. Kısaca, on akupunktur iğneleri (uzunluk x 13 mm, çap olarak 0.2 mm) yapışkan bant ile bir paket içinde bağlanmıştır. ilgi konusu transgeni ihtiva eden plasmid DNA, 10 ug PBS 10 uL bir hacmi tıraş, tüy dökücü krem ​​ile muamele edilmiş yan deri üzerine yerleştirilmiştir. cilt yüzeyine (1 cm x 1 cm) salınmasına akupunktur iğne demeti kullanılarak, dik katmanında keratin gevşetilmiş ve yüzeye uygulanır plazmid DNA epidermise absorbe edildi. Cilt hasarı izlenir ve minimal olduğu bulunmuştur. acufected deride transfekte olmuş bir genin ekspresyonu, hem nicel gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) ve ELISA ile doğrulandı. Deri iltihabı ile acufection teslim, IL-15ΔE7 immün modülatör etkileri IMQ ile muamele edilmiş fare modeli 12 ile gösterilmiştir. acufection kanıtlıyor olsa kolay ve daha az dema olmakin vivo olarak DNA nakli için bir yöntem nding, farklı genler ve cilt dikmek için kez, en uygun DNA miktarı da yeniden üretilebilir sonuçlar elde etmek için optimize edilmelidir.

Protocol

8'de Dişi fareler – 12 haftalıkken bu çalışma için kullanıldı. C57 / BL6 sokak türü (WT) ve eksik IL-15 (IL-15'te – / -) fareler sırasıyla Ulusal Laboratuvarı Hayvan Merkezi (NLAC), Tayvan ve Taconic Farm, satın alınmıştır. IL15 +/- heterozigot çaprazlamasından ikinci kuşak: 3 oranında IL eksikliği-15-(IL15 – / -) ve IL-15-baskın (IL15 +/- ve IL15 + / +), 1 gösterdi. IL15 genotipi – / – fareleri, PCR analizi ile te…

Representative Results

Bazı kızarıklık akupunktur iğne ile delmeden sonra ilk saat içinde belirgin iken, cilt 2 gün temizlenir ve 7 gün kadar olumsuz deri reaksiyonu (Şekil 2A) batıcı sonra gözlenmiştir. İğne iğneleyici görmemiş deri (Şekil 2B) ile karşılaştırıldığında, H & E analizi ile epidermal orthokeratosis ve en az deri infiltrasyonu çok düşük seviyede indüklenmiş. Epidermal kalınlık (?…

Discussion

acufected plazmid DNA 'nın ekspresyonunu sağlamak için en önemli nokta, eşit salınım ve derinin boynuzsu tabaka gevşetilmesidir. Cildi kesilmeden hafifçe iğneler iterken, kuvvet yüzeyini bastırmak için yeterince sert olmalıdır. 1 cm x 1 cm yüzey alanı 10 uL çözelti içinde DNA emilmesini kolaylaştırmak için, iğneler 30 s, yaklaşık 100 kez yukarı ve aşağı salınım hareketi. Bir cilt prick gerekiyor kuvveti belirlemek ve acufected genin en iyi ifadesi seviyesini elde etmek için gerekli o…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan hibe ile desteklenen (EN 103-2633-B-002-002; 104-2320-B-002-048). Biz Dr teşekkür ederim. el yazması okumak için Betty Wu-Hsieh ve Hawaii Üniversitesi'nde Stanford Üniversitesi ve Dr Peter Hoffmann NTU'da Chien-Kuo Lee Leigh Zerboni, Tarım Biyoteknoloji teknik yardım için NTU'da Yun Chien ve Dr Wen-Chi Wei teknik tavsiye için Sinica Akademisi Araştırma Merkezi.

Materials

Accu Handy Needle Accu 36Gx0.5 Medical device
NairTM Lotion Church & Dwight N/A Use to remove hair
Shandon Xyline substitute Thermo Fisher Scientific 6764506 Deparaffinization
Avertin (2,2,2-Tribromethanol) Sigma-Aldrich T4,840-2 Anesthesia
2-methyl-2-butanol Sigma-Aldrich 152463 Solvent for the dissolution of avertin
DifcoTM LB broth, Miller BD 244620 Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology
QIAGEN Plasmid Midi Kit QIAGEN 12143 Purification of plasmid DNA from E. coli
Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit eBioscience 88-7215 Measure IL-15 protein
Anti-mouse Ly6G BioLegend 127601 Antibody used for immunohistochemical stain
anti-mouse Ki-67 eBioscience 14-5698-80 Antibody used for immunohistochemical stain
Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) Nichirei Biosciences 414341F Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain
DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-4100 Peroxidse substrate for immunohistochemical stain
Ultra V block Thermo Fisher Scientific TA-060-UB Reduce nonspecific background staining
Methyl green Sigma-Aldrich M8884 Nuclear staining
Vecta MountTM Vector Laboratories M-5000 Permanently preserving histochemical stains
Protease inhibitor cocktail tablets Roche 04-693-116-001 Inhibit protease activity in cell lysate
Aldara cream 3M Parmaceuticals N/A 5% imiquimod cream
Bessman Tissue Pulverizer Spectrum Labs 189475 Use to pulverize skin tissue
ABI7900HT cycler Thermo Fisher Scientific N/A quantitative real-time PCR assay
Camcorder Panasonic HDC-SD60 Image documentation
Axio Scope.A1 ZEISS N/A Bright-field microscopy
ScanScopeXT Aperio N/A Whole-field image scanner
MetaMorphⓇ Research Imaging Molecular Devices N/A Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells

Referências

  1. Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
  2. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews. 9, 679-691 (2009).
  3. Liu, L. J., et al. Topical application of HIV DNA vaccine with cytokine-expression plasmids induces strong antigen-specific immune responses. Vaccine. 20, 42-48 (2001).
  4. Lu, B., Federoff, H. J., Wang, Y., Goldsmith, L. A., Scott, G. Topical application of viral vectors for epidermal gene transfer. J Invest Dermatol. 108, 803-808 (1997).
  5. Partidos, C. D. Delivering vaccines into the skin without needles and syringes. Expert Rev Vaccines. 2, 753-761 (2003).
  6. Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
  7. Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 9568-9572 (1990).
  8. Tang, D. C., DeVit, M., Johnston, S. A. Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152-154 (1992).
  9. Haynes, J. R. Particle-mediated DNA vaccine delivery to the skin. Expert Opin Biol Ther. 4, 889-900 (2004).
  10. Tuomela, M., et al. Biodistribution and general safety of a naked DNA plasmid, GTU-MultiHIV, in a rat, using a quantitative PCR method. Vaccine. 23, 890-896 (2005).
  11. Eriksson, E., et al. In vivo gene transfer to skin and wound by microseeding. J Surg Res. 78, 85-91 (1998).
  12. Lee, T. L., et al. An alternatively spliced IL-15 isoform modulates abrasion-induced keratinocyte activation. J Invest Dermatol. 135, 1329-1337 (2015).
  13. Rudy, S. J. Imiquimod (Aldara): modifying the immune response. Dermatol Nurs. 14, 268-270 (2002).
  14. van der Fits, L., et al. Imiquimod-induced psoriasis-like skin inflammation in mice is mediated via the IL-23/IL-17 axis. J Immunol. 182, 5836-5845 (2009).
  15. Sumida, H., et al. Interplay between CXCR2 and BLT1 facilitates neutrophil infiltration and resultant keratinocyte activation in a murine model of imiquimod-induced psoriasis. J Immunol. 192, 4361-4369 (2014).
  16. Bamford, R. N., DeFilippis, A. P., Azimi, N., Kurys, G., Waldmann, T. A. The 5′ untranslated region, signal peptide, and the coding sequence of the carboxyl terminus of IL-15 participate in its multifaceted translational control. J Immunol. 160, 4418-4426 (1998).
  17. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77, 61-68 (1989).
  18. Tan, X., Lefrancois, L. Novel IL-15 isoforms generated by alternative splicing are expressed in the intestinal epithelium. Genes Immun. 7, 407-416 (2006).
  19. Basner-Tschakarjan, E., Mirmohammadsadegh, A., Baer, A., Hengge, U. R. Uptake and trafficking of DNA in keratinocytes: evidence for DNA-binding proteins. Gene Ther. 11, 765-774 (2004).
  20. Fan, H., Lin, Q., Morrissey, G. R., Khavari, P. A. Immunization via hair follicles by topical application of naked DNA to normal skin. Nat Biotechnol. 17, 870-872 (1999).
  21. Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes’ response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. J Invest Dermatol. 132, 105-113 (2012).

Play Video

Citar este artigo
Lin, Y., Lee, T., Ku, C. Development of an Economical DNA Delivery System by “Acufection” and its Application to Skin Research. J. Vis. Exp. (122), e55206, doi:10.3791/55206 (2017).

View Video