Summary

Non invasivo<em> In Vivo</em> Fluorescenza ottica di imaging dell'attività MMP infiammatoria utilizzando un agente fluorescente di imaging attivo

Published: May 08, 2017
doi:

Summary

Questo articolo spiega l'applicazione dell'immagine fluorescente utilizzando una sonda ottica attivabile per la visualizzazione dell'attività in vivo delle metalloproteinasi di matrici chiave in due diversi modelli sperimentali di infiammazione.

Abstract

In questo articolo si descrive un metodo non invasivo per l'attività di matrice metalloproteinasi (MMP) di imaging mediante una sonda fluorescente attiva, tramite l' ottica ottica (OI) in fluorescenza in vivo , in due diversi modelli di infiammazione: un artrite reumatoide (RA) e un contatto Modello di reazione di ipersensibilità (CHR). La luce con una lunghezza d'onda nella finestra vicino a infrarossi (NIR) (650 – 950 nm) consente una penetrazione più profonda del tessuto e un assorbimento minimo del segnale rispetto alle lunghezze d'onda inferiori a 650 nm. I principali vantaggi che usano l'OI di fluorescenza è che è conveniente, veloce e facile da implementare in diversi modelli animali.

Le sonde fluorescenti attivatabili sono otticamente silenziose nei loro stati inattivati, ma diventano altamente fluorescenti quando attivata da una proteasi. I MMP attivati ​​portano alla distruzione dei tessuti e svolgono un ruolo importante per la progressione della malattia nelle reazioni di ipersensibilità di tipo ritardato (DTHR) come RA e CHR. Inoltre, i MMP sonoLe proteasi chiave per la cartilagine e il degrado dell'osso e sono indotti da macrofagi, fibroblasti e condrociti in risposta a citochine pro-infiammatorie. Qui usiamo una sonda che viene attivata dai MMP chiave come MMP-2, -3, -9 e -13 e descrivono un protocollo di imaging per l'attività di fluorescenza vicino all'infrarosso OI dell'attività MMP in RA e nei topi di controllo 6 giorni dopo l'induzione della malattia Come nei topi con l'acuto (1x challenge) e la cronica (5x challenge) CHR sull'orecchio destro rispetto alle orecchie sane.

Introduction

Le malattie autoimmuni come l'artrite reumatoide (RA) o la psoriasi vulgaris sono classificate come reazioni di ipersensibilità di tipo ritardato (DTHR). 1 RA è una malattia autoimmune comune caratterizzata da sinovite erosiva e distruzione congiunta. 2 Le articolazioni artrite infiammate dimostrano l'infiltrazione e la proliferazione delle cellule infiammatorie, una maggiore espressione di cellule pro-infiammatorie che portano alla formazione di pannus, alla cartilagine e alle distruzioni dell'osso. 3 , 4 La scissione di molecole di matrice extracellulare, come il collagene mediante matrici metalloproteinasi (MMPs), è essenziale per la conversione e l'angiogenesi dei tessuti e provoca distruzioni del tessuto. 5 , 6 Le reazioni di ipersensibilità di contatto (CHR) sono caratterizzate dall'aggregazione di neutrofili che portano ad uno scoppio ossidativo. 7 Simili a RA, i MMP in CHR sono involved nella conversione dei tessuti, la migrazione cellulare e l'angiogenesi per stabilire infiammazione cronica.

Per studiare RA, il glucosio-6-fosfato isomerasi (GPI) iniezione -serum modello di topo è stato utilizzato. 8 siero di topi K / BXN transgeniche contenenti anticorpi contro GPI, è stato iniettato in topi BALB / c naive dopodiché infiammazione reumatica cominciato a svilupparsi entro 24 h con un massimo di edemi declivi il giorno 6 dopo l'iniezione GPI-siero (vedi 1.1). Per analizzare CHR cronica, topi C57BL / 6 sono stati sensibilizzati con trinitrochlorobenzene (TNCB) sull'addome. L'orecchio destro è stato sfidato fino a 5 volte a partire 1 settimana dopo la sensibilizzazione (vedi anche 1.1 e 1.2).

Non invasiva piccoli animali OI è una tecnica basata sulle indagini in vivo del fluorescente-, chemiluminescent- e bioluminescenti-segnali, che vengono utilizzati principalmente nella ricerca preclinica. I dati semiquantitativa acquisita dà intuizioni nel MolecMeccanismi Ular negli organi e tessuti sani e modelli animali sperimentali malati, e consente longitudinale follow up misure (ad esempio per valutare profili di risposta terapeutica in vivo). Un grande vantaggio di studi longitudinali è la riduzione del numero di animali, come gli stessi animali possono essere misurati in studi di follow up in diversi punti temporali invece di utilizzare mouse diversi per punto temporale. La risoluzione di OI permette imaging funzionale dettagliata di organi e strutture tissutali più piccole in animali da esperimento.

L'uso di specifici filtri eccitazione e di emissione con uno spettro di trasmissione ristretta, una protezione contro luce diffusa da una tenuta di luce "scatola scura" ed un dispositivo charged-coupled sensibili (CCD), che viene raffreddata in molti dispositivi fino a -70 ° C , permette altamente specifico e misurazioni sensibili dei segnali di fluorescenza.

Utilizzando agenti fluorescenti con excitation- eGli spettri di emissione nella finestra di fluorescenza ad infrarossi vicino (650 – 950 nm), i rapporti segnale-rumore possono essere migliorati significativamente. La finestra a fluorescenza a infrarossi vicino è caratterizzata da un assorbimento relativamente basso del segnale da parte dell'emoglobina e dell'acqua così come una bassa fluorescenza di fondo. 9 Questo permette una profondità di penetrazione fino a 2 cm nel tessuto dei piccoli animali. Le sonde OI possono indirizzare direttamente un bersaglio ( ad esempio mediante un anticorpo a fluorescenza) oppure possono essere attivate nel tessuto bersaglio (per es. Mediante proteasi). Le sonde OI attuabili sono otticamente silenziose nella loro forma inattivata a causa del trasferimento di energia di risonanza di Förster (FRET) ad una parte di quenching, che trasferisce l'energia di eccitazione all'interno della molecola ad un altro dominio. Se il colorante viene ceduto (ad esempio da una proteasi), l'energia non è più trasferita all'interno della molecola e un segnale fluorescente può essere rilevato da OI. Ciò consente la progettazione di sonde OI ad alta specificitày per processi biologici distinti ed eccellenti segnale-rumore-ratio.

Il protocollo che segue illustra in dettaglio la preparazione degli animali, le misurazioni OI utilizzando una sonda OI Activatable all'immagine MMP-2, -3, -9 e -13 attività in vivo e due modelli sperimentali di infiammazione (RA, CHR).

Protocol

Tutte le procedure descritte in questo documento, hanno seguito le linee guida e standard internazionali di cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato locale il benessere degli animali ed etica del Paese Commissione Tuebingen, in Germania. 8 – topi 12 settimane BALB / ce C57BL / 6 sono stati tenuti al 12 h: 12 h di luce: buio ciclo e sono stati alloggiati in IVCS e condizioni ambientali standard a 22 ± 1 ° C in gruppi di 2 – 5 con acqua e alimento accesso ad libitum. <p…

Representative Results

Per indurre l'artrite reumatoide (RA) in topi naive BALB / c, gli animali sono stati iniettati ip con auto-anticorpi (1: 1 diluizione con PBS 1x) contro GPI al giorno 0. L'infiammazione massima (gonfiore alle caviglie) in questo GPI-siero indotta modello di RA è il giorno 6 dopo l'iniezione 11. Pertanto, 2 nmol del colorante OI attivabile stata preparata ed iniettata iv nella vena caudale di topi artritici e animali sani di controllo…

Discussion

OI è uno strumento molto utile, veloce e poco costoso per l'imaging molecolare non invasivo in vivo nella ricerca preclinica. Una particolare forza di OI è la capacità di monitorare processi altamente dinamici come risposte infiammatorie. Inoltre, l'OI permette di seguire il corso di una malattia per un lungo periodo di tempo, che va dai giorni alla settimana.

L'OI ha diversi vantaggi rispetto ad altre modalità di imaging in vivo , come la tomografi…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo Daniel Bukala, Natalie Altmeyer e Funda Cay per un ottimo supporto tecnico. Ringraziamo Jonathan Cotton, Greg Bowden e Paul Soubiran per aver redatto il manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Werner Siemens e dalla Facoltà di Medicina dell'Università Eberhard Karls Tübingen ('' Promotionskolleg '') e dal DFG attraverso la CRC 156 (progetto C3).

Materials

Cornergel Gerhard Mann GmbH 1224635 ophthalmic ointment 
Forene Abbott GmbH 4831850 isoflurane
U40 insulin syringe Becton Dickinson and Company 324876
Heparin Sintetica 6093089
High-Med-PE 0.28×0.61mm Reichelt Chemietechnik GmbH+Co 28460 polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm 
BD Regular Bevel Needles, 30 G Becton Dickinson & Co. Ltd. 305106 30 G injection cannula
RTA-0011 isoflurane vaporizer Vetland Medical Sales and Services LLC
Artagain drawing paper Strathmore Artist Paper 446-8 coal black
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262 Optical imaging system
BD Regular Bevel Needles, 25 G Becton Dickinson and Company 305122
2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene Sigma Aldrich GmbH 7987456F TNCB
MMPSense 680 Perkin Elmer  NEV10126 fluorescent imaging dye
Oditest  Koreplin GmbH C1X018 mechanical measurment
Miglyol 812 SASOL Oil
 BALB/C, C57BL/6 Charles River Laboratories  Mice used for experiements
PBS Sigma Aldrich GmbH For dilution of the RA serum 
Pipette (100µl) Eppendorf  Used for TNCB application 
shaver  Wahl  9962 Animal hair trimmer
Living Image  Perkin Elmer  Imaging software to measure OI

Referências

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Citar este artigo
Schwenck, J., Maier, F. C., Kneilling, M., Wiehr, S., Fuchs, K. Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent. J. Vis. Exp. (123), e55180, doi:10.3791/55180 (2017).

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