大規模な再建と選択的集団のニューロンを分類するために形態学的指標に基づいて独立、不偏クラスタリング
Summary
このプロトコルは、選択的ニューロン集団の大規模な再構成を説明し、蛍光マーカーを発現する修正された狂犬病ウイルス、および独立した、公平なクラスタとラベルされた次の逆行性感染症は、それが明確なニューロンのサブクラス間の形態学的評価指標の包括的な特性評価を可能に分析します。
Abstract
このプロトコルは、独立した公正なクラスタリングの使用と組み合わせニューロンの大規模な再構成を概説し、選択的ニューロン集団の間で観察された形態学的特徴の総合的な調査を作成するために分析します。これらの技術の組み合わせは、神経解剖学的データの収集と分析のための新規なアプローチを構成しています。一緒に、これらの技術は、大規模を可能にし、したがって、より包括的、選択的ニューロン集団のサンプリングと集団内の形態学的にユニークなニューロンのクラスを記述するための公平な定量的な方法を確立します。
プロトコルは、選択的ニューロンを標識するための修正された狂犬病ウイルスの使用を概説します。 G-削除された狂犬病ウイルスは、目的の標的脳構造に定位注射後の逆行性トレーサーのように機能し、神経細胞におけるEGFPの送達および発現のための車両として機能します。ニューロンの数が多いと、これを使用して感染しています技術および個々のニューロンの「ゴルジ様」完全な塗りつぶしを生産、彼らの樹状突起全体にGFPを発現します。したがって、ウイルス媒介逆行性トレーシング法は、完全な細胞内の塗りつぶしを生成することによって、従来の染料ベースの逆行トレース技術に改良を加えます。
研究下の脳領域の全領域に及ぶ個々のウェルに単離されたニューロンは、ニューロンの代表的なサンプルを得るために、再構成のために選択されます。プロトコルは、細胞体を再構築し、複数の組織切片にまたがるラベルされたニューロンの樹状突起樹枝状のパターンを完了するための手順の概要を説明します。脳構造内の各ニューロンの位置を含む形態学的データは、さらなる分析のために抽出されます。標準のプログラミング機能は、独立したクラスター分析し、形態学的指標に基づいて、クラスタの評価を行うために利用されました。クラスタ分析perfoのこれらの分析の有用性、統計的評価を確認するにはマカクザルの視床（TRN）の視床網様核に再構成された160のニューロンに行われたrmed。元のクラスター分析とここで行われる統計的評価の両方がTRNニューロンは3亜集団、ユニークな形態学的特性を持つそれぞれに分離されていることを示しています。
Introduction
神経解剖学は、神経科学1の基盤の一つであり、「connectomics」の最近の関心は、ニューロン集団および特定のニューロン2との間の接続の形態的多様性を理解するための熱意をリニューアルしました。標識するための方法および復元ニューロンが大きく、遺伝的およびウイルス媒介回路トレースを含む最近の技術革新と改善しているニューロン集団5のより包括的な形態学的調査を可能にする、3、4に近づきます。個々のニューロンを標識の改善に加えて、定量的なデータ分析技術はまた、それは形態学的データ5、6に基づいて個別の亜集団にニューロンの独立した公正な分類を可能に浮上しています。これらの公平の技術は、よりtraditiona時に改善されています一世紀以上にわたって分野における標準をされているリットル定性的な分類方法。本研究の目的は、アウトラインステップバイステップすることで、選択的な集団内のニューロンのウイルス媒介標識の組み合わせは、これらのニューロンの包括的なサンプル、および定量的なデータ分析の大規模な再構成が持つ独立したクラスタリングに基づきます統計的評価。これらの方法を組み合わせることにより、我々は包括的サンプリングと選択的ニューロン集団内の形態学的にユニークな神経細胞の種類の公平な分類を容易にするために、神経解剖学データの収集と分析に向けた新たなアプローチを概説します。
これらの方法の一例として、我々はマカクザルの視床網様核（TRN）の単一のセクタ内のニューロンの大集団の我々の分析について説明します。これらのデータは、以前の研究7からのものです。選択的背Lateraのに突出したTRNニューロンを標識するための方法EGFP 4、8をコードする改変狂犬病ウイルスの外科的注入を使用して視床（dLGN）のリットルの膝状核が概説されている（ 具体的な材料/設備 、行2 の表を参照してください）。この修正された狂犬病ウイルスは、ウイルスのトランスシナプスの動きを排除する必須のコートタンパク質をコードする遺伝子を欠いています。ウイルスが注射部位での軸索終末に入ると、それは、感染したニューロン5、9、10の完全な樹状樹枝状全体でEGFPの発現を駆動する重要な利点を持つ伝統的な逆行性トレーサーのような役割を果たします。従って、このG欠失狂犬病ウイルスは、選択的に注入し、逆行性輸送、次のいずれかのニューロン集団に感染し、標識するために使用することができます。
特定のニューロン集団の総合的な分析を行うために、それからサンプリングすることが重要です集団内のニューロンの広い分布。ウイルス媒介性標識技術は、完全な細胞内に生成するので、「ゴルジ様」は、ウイルス注射部位における軸索を有する多くのニューロンの充填は、脳構造の完全な範囲内でのニューロンの非常に大きなサンプルを再構成することが可能です。修正された狂犬病ウイルスが感染したニューロンの多数の標識に非常に効果的であるため、また、動物あたりのニューロンの数百を再構成することが可能です。 dLGN投射TRNニューロンの総合的なサンプルを生成するために、TRN 11の視覚的なセクター全体で160ニューロンをサンプリングするための手順が概説されています。顕微鏡、カメラ、および再構成ソフトウェアを含むニューロンの再構成システムを使用して個々のニューロンを再構成する過程を説明します。また（TRN内この場合）脳構造内の個々のニューロンの位置を決定し、ウイルス注入SITを検証する方法が記載さ体積輪郭再構成を使用して（dLGN内でこの場合）構造内の電子の量と場所。形態学的データをエクスポートして、独立したクラスタが各ニューロンのために測定された形態学的評価指標に基づいて分析を実行する手順の概要は次のとおりです。クラスタリング手法には限界がありますし、利用可能な異なるクラスタリングアルゴリズムの様々なもあります。したがって、これらのオプションは、より一般的に使用されるアルゴリズムのいくつかの利点が記載されています。クラスター分析は、クラスタの一意の統計的な検証を提供していません。そのため、追加の手順が最適なクラスタリングだけでなく、クラスタ内および全体の形態学的データ間の関係を確認するために概説されています。そのTRNニューロンを確認するために、TRNデータセットのクラスタを評価するための統計的方法が記載されている10の独立した形態学的指標に基づいて、3つのユニークなクラスタにグループ化されています。
このように、選択的に標識するための手順を概説することにより、、再構築、および特定のニューロン集団から形態学的データを分析し、我々は集団内のニューロン間の形態学的差異を定量化するための方法が記載されています。マカクザルのTRNの視覚的なセクタ内の異なるニューロンタイプの前の調査結果は、別の統計的評価法で確認されています。一緒に、我々は、これらの技術は神経解剖学的データセットに広く適用することと脳を介してニューロン集団の多様性の定量的な分類を確立するのに役立ちます願っています。
Protocol
Representative Results
Discussion
神経解剖学の研究では、神経科学とconnectomicsと構造と機能の関係の最近の関心の柱が選択的ニューロン集団の詳細な形態学的特徴付けのために熱意を更新したままです。伝統的に、神経解剖学の研究では、専門家のneuroanatomistsによって定義されたニューロンの形態学的に異なるクラスにニューロンの定性的な分類に依存してきました。ニューロンを再構築し、形態学的データを抽出するため?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、博士に感謝したいと思います。エド・キャロウェイとマーティUsrey私たちは神経細胞再構成のヘルプのための先行研究とリビーFairlessとShiyuan劉の一部として調製された組織を使用することを可能にするため。ホワイトホール財団：この作品は、NIH（EY018683 NEI）によって賄われていました。
Materials
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen – must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
Referências
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