Epizomal vektörlerin kullanılması insan periferik kan mononükleer hücrelerinden entegrasyon içermeyen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi
Summary
This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.
Abstract
Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin (iPSCs) hastalığı modelleme ve rejeneratif tedaviler için büyük umut tutun. Daha önce periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PB MNC) Entegrasyon içermeyen iPSCs oluşturmak için epizomal vektörlerin (EV) kullanımını bildirdiler. Kullanılan epizomal vektör, sırasıyla, memeli hücrelerinde plazmid replikasyonu ve uzun süreli tutuculuk izin Epstein-Barr (EB) virüs oriP ve EBNA1 serisi elemanları ile dahil, DNA plasmidleri bulunmaktadır. Daha fazla optimizasyonu ile, iPSC koloni binlerce periferal kan 1 mL elde edilebilir. yüksek yeniden programlama verimi elde etmek için iki kritik faktörler şunlardır: 1) 2A kullanımı "öz-bölünme" peptid böylece iki faktörün ekimolar ifadesini elde, Oct4 ve Sox2 bağlamak; 2) İki vektörün kullanımı myc ve Klf4 ayrı ayrı ifade etmek. Burada entegrasyon-Free IP üretmek için bir adım-adım protokolü açıklamakErişkin periferik kan örneklerinden SC'ler. artık epizomal plazmidler beş pasajlar sonra saptanamaz olarak üretilen iPSCs entegrasyon içermez. yeniden programlama verimliliği Sendai virüsü (SV) vektörler ile karşılaştırılabilir olduğu, ancak, EV plasmidleri çok daha ekonomik bir ticari olarak temin edilebilir SV vektörler daha vardır. Bu uygun fiyatlı EV yeniden programlama sistemi rejeneratif tıp klinik uygulamalar için potansiyel tutar vb entegrasyon serbest mezenkimal kök hücrelerin, nöral kök hücreler, PB çokuluslu şirketlerin doğrudan yeniden programlama için bir yaklaşım sağlar.
Introduction
birkaç transkripsiyon faktörlerinin zorla ifade sonra (Yani Oct4, Sox2, MYC ve Klf4), somatik hücre yenileyici tıp ve hücre replasman tedavisinde 1-3 uygulamalar için büyük umut tutun kaynaklı pluripotent Kök Hücre (iPSCs), için yeniden olabilir. Bugüne kadar, çeşitli yöntemler 4-7 yeniden programlama başarı oranını arttırmak için geliştirilmiştir. Viral entegrasyon yeniden programlama faktörleri, yüksek düzeyde stabil ekspresyon yol açtığı için viral vektörler kaynaklı yeniden programlama yaygın iPSCs verimli üretimi için kullanılır. Ancak, hücre genomuna vektör DNA kalıcı entegrasyon sokma mutagenezi 5 indükleyebilir. Buna ek olarak, yeniden programlama faktörleri yetersiz inaktivasyon iPSCs farklılaşmayı 8 rahatsız edebilir. Bu nedenle, yeniden programlama faktörleri katılımı olmadan iPSCs kullanımı, özellikle, hücre terapisi uygulamalarında kullanımı için zorunludur.
<p class="jove_content"> Epizomal Vektörleri (AGH) yaygın entegrasyon serbest iPSCs üretilmesinde kullanılmaktadır. En yaygın olarak kullanılan EV, Epstein-Barr (EB) virüs 9 iki elemanları, viral replikasyon (oriP) EB Nükleer Antijen 1 (EBNA1 serisi) kökeni içeren bir plazmiddir. EBNA1 serisi elemanı konakçı hücrenin bölünmesi sırasında epizom bölünmesi sağlar kromozomal DNA'ya oriP içeren plazmid DNA tethers ise oriP elemanı, memeli hücrelerinde plazmid replikasyonunu teşvik eder. Sendai virüsü (SV) ve RNA transfeksiyonu da dahil olmak üzere diğer entegrasyon içermeyen yaklaşımlar ile kıyaslandığında EVS çok sayıdaki avantajları, 5,6,10 sahiptirler. Onları son derece uygun hale plazmid DNA olarak, AGH kolayca üretilebilir ve evde güncellenmiştir. Buna ek olarak, EV yeniden programlama çeşitli RNA transfeksiyon başarı yeniden programlama için gerekli olan ise EVs tek bir transfeksiyon, iPSC üretimi için yeterli olan daha az olan bir emek-yoğun bir işlemdir.DErmal fibroblastlar birçok yeniden programlama çalışmalarında kullanılmıştır. Ancak, deri biyopsisi invaziv ve ağrılı bir süreç değil, aynı zamanda yeniden programlama için yeterli miktarlarda hücreleri genişletmek için zaman alıcı değil sadece. Daha büyük bir endişe, yetişkin donörlerin deri hücreleri genellikle böylece deri fibroblastları 11,12 türetilen iPSCs başvurularını sınırlayıcı, tümörlerle ilişkili mutasyonlara yol açabilir uzun süreli UV ışık radyasyon, maruz kalmıştır. Son zamanlarda, normal insan derisi hücreleri somatik mutasyonlara ve deri skuamöz hücreli karsinom anahtar sürücülerin çoğu dahil olmak üzere birçok kanser genleri, birikir olduğu bildirilmiştir, güçlü pozitif seleksiyon 13 altındadır.
1) kan hücreleri kolayca minimal invaziv bir proses ile elde edilebilir, çünkü deri fibroblastları tersine, periferik kan (PB) hücreleri yeniden programlama için bir hücre tercih kaynağıdır, 2) periferal kan hücreleri, hematopoetik kök hücre soyu olanKemik iliğinde bulunan, böylece zararlı ışınlarından korunmalıdır. Periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PB MNC) Ficoll-Hypaque (1.077 gr / ml) ile basit bir gradyan santrifüj aşağıdaki ince beyaz tabaka katmandan bir saat içinde toplanabilir. Elde edilen PB uluslu şirketlerin lenfositler, monositler ve birkaç hematopötik projenitör hücrelerin (HPC) 14 oluşur. Insan T lenfositleri, PB büyük hücre tipleri bulunmaktadır olgun karşın T hücreleri, T hücre reseptörünün (TCR) genlerinin yeniden düzenlemeleri içerir ve bu nedenle uygulama 15,16 için potansiyellerini sınırlayıcı sağlam bir genom yoksundur. Ancak, iPSC nesil yoluyla T hücrelerinin gençleştirme Kimerik Antijen Reseptör (SYR) T-hücre tedavisi 17-19 potansiyel uygulamalar olabilir. Buna karşılık, HPC sağlam bir genom ve kolaylıkla yeniden programlanabilir bulunmaktadır. Sadece 0.01 olmasına rağmen – periferik dolaşımda% 0.1 hücreleri HPC bulunmakta, bu hücreler genişletilebilir ex vivo eritroid ortamda kızarıklara çoğalmasını yana olduğunuoid progenitör hücreler 14.
Daha önceki çalışmamızda, biz PB yeniden programlama verime 20 10x artışa neden Yamanaka faktörleri (Oct4, Sox2, MYC ve Klf4), ek faktör BCL-XL kullanılır. Ayrıca BCL2L1 şekilde bilinmektedir BCL-XL, kaspaz 21,22 aktivasyonunu inhibe ederek hücre ölümüne güçlü bir inhibitörüdür. Fakat, BCL-XL ayrıca pluripotensini 21,22 sürdürülmesinde önemli bir rol oynayabilir. Son zamanlarda, biz daha fazla ayrı ayrı yeniden programlama verimliliği 23 yaklaşık 100x artışa yol açar iki vektörleri ile MYC ve Klf4 ifade ederek bizim EV yeniden programlama sistemi optimize ettik. Sağlıklı vericilerden 0.5% – Bu yöntem kullanılarak, transfeksiyon hücre sayısını başlangıç bölünmesiyle koloni sayısı ile tanımlanan yeniden programlama etkinliği, 0.2'dir. aşağıdaki gibi biz PB entegrasyonu ücretsiz iPSCs üretmek için detaylı deneysel prosedürü açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sağlıklı donörlerden veya hastalardan alınan kan örnekleri Kazanılması temel araştırma ve klinik hücre terapisi için çekici bir hücre kaynağı yapma, rahat ve non-invaziv olduğunu. Burada periferik kan örneklerinden entegrasyon serbest iPSCs yüksek verimli üretimi için bir protokol tanımlanmıştır. Bu tekrarlanabilir ve uygun fiyatlı bir yaklaşım iPSC alanını yararına olmalıdır.
Biz yüksek verimli PB yeniden programlama 30 sorumlu iki kritik faktör…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Ministry of Science and Technology of China (2015CB964902, 2013CB966902 and 2012CB966601), the National Natural Science Foundation of China (81500148, 81570164 and 81421002), the Loma Linda University School of Medicine GCAT grant (2015), and Telemedicine and Advanced Technology Research Center (W81XWH-08-1-0697).
Materials
| Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma | S0192 | Store at 4 °C |
| Human stem cell factor (SCF) | Peprotech | 300-07 | Store at -20 or -80°C |
| Interleukin-3 (IL-3) | Peprotech | AF-200-03 | Store at -20 or -80°C |
| Eryrthropoietin (EPO) | Peprotech | 100-64 | Store at -20 or -80°C |
| Insulin growth factor-1 (IGF-1) | Peprotech | 100-11 | Store at -20 or -80°C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Store at -20 or -80°C |
| 1-thioglycerol (MTG) | Sigma | M6145 | Store at -20 or -80°C |
| DMEM/F12 medium | Gibco | 112660-012 | Store at 4 °C |
| L-glutamine (100x) | Gibco | 25030-081 | Store at -20 °C |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Gibco | 15140-122 | Store at -20 °C |
| Non-essential amino acids solution (100x) | Gibco | 11140-050 | Store at 4 °C |
| Fibroblast growth factor 2 (FGF2) | Peprotech | 100-18B | Store at -20 or -80°C |
| ITS (100x) | Gibco | 41400-045 | Store at 4 °C |
| Ascorbic acid | Sigma | 49752 | Store at -20 °C |
| DMEM (high glucose) medium | Thermo | SH30243.01B | Store at 4 °C |
| FBS | Hyclone | SV30087.01 | Store at -40 °C |
| Ficoll | GE Healthcare, SIGMA | 17-5442-02 | Store at RT |
| Trehalose | Sigma | T9531 | Store at 4 °C |
| DMSO | Sigma | D2650 | Store at RT, protect from light |
| Endofree Plasmid Maxi Kit(10) | Qiagen | 12362 | Store at RT |
| IMDM | Gibco | 21056-023 | Store at 4 °C |
| Human CD34+ Cell Nucleofection Kit | Lonza | VPA-1003 | Store at RT, nucleofection buffer and supplement buffer should be stored at 4 °C |
| Sodium butyrate | Sigma | B5887 | Store at -20 or -80°C |
| ROCK inhibitor Y27632 | STEMGENT | 04-0012-10 | Store at -20 °C |
| Essential 8 basal medium (E8) | Gibco | A15169-01 | Store at 4 °C, the supplement should be stored at -20 or -80°C |
| Matrigel | BD | 354277 | Store at -20 or -80°C |
| 2x EasyTaq PCR SuperMix(+dye) | TransGen Biotech | AS111 | Store at -20 °C |
| Cell detachment solution | STEMGENT | 01-0006 | Store at -20 °C, Accutase as a cell detachment solution to obtain a single cell suspension |
| DAPI | Sigma | D9542-1MG | Store at 4 °C or -20 °C |
| Anti-nanog-AF488 | BD | 560791 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
| Anti-OCT4 | abcam | ab19857 | Store at 4 °C, primary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/100 when use |
| AF488 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A21202 | Store at 4 °C, secondary antibody used for Immunofluorescence, dilute 1/500 when use |
| PE anti-human TRA-1-60-R Antibody | Biolegend | 330610 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| eFluor 570-conjugated anti-SSEA4 | eBioscience | 41-8843 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| Isotype antibody | eBioscience | 11-4011 | Store at 4 °C, antibody used for flow cytometry |
| Alkaline Phosphatase Detection Kit | SiDanSai | 1102-100 | Store at 4 °C |
| Genomic DNA Extraction Kit | TIANGEN | DP304-02 | Store at RT |
| Trypan Blue solution | Sigma | T8154 | Store at RT |
| Flow cytometry cell analyzer | BD | LSRII | for flow cytometry analysis |
| Spinning disk confocal microscope (SDC) | PerkinElmer | UltraVIEW VOX | for confocal imaging |
| Nucleofection device | Lonza | Nucleofector 2b | for the nucleofection of PB MNC |
| ImageQuant LAS-4010 | GE | take photo of AP staining in bulk |
Referências
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Trounson, A., McDonald, C. Stem Cell Therapies in Clinical Trials: Progress and Challenges. Cell Stem Cell. 17, 11-22 (2015).
- Hayes, M., Zavazava, N. Strategies to generate induced pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 1029, 77-92 (2013).
- Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11, 264-274 (2013).
- Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33, 58-63 (2015).
- Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31, 458-466 (2013).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9, 588-598 (2011).
- Dorigo, O., et al. Development of a novel helper-dependent adenovirus-Epstein-Barr virus hybrid system for the stable transformation of mammalian cells. J Virol. 78, 6556-6566 (2004).
- Dowey, S. N., Huang, X., Chou, B. K., Ye, Z., Cheng, L. Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells from postnatal blood mononuclear cells by plasmid vector expression. Nat Protoc. 7, 2013-2021 (2012).
- Harms, P. W., et al. Next generation sequencing of Cytokeratin 20-negative Merkel cell carcinoma reveals ultraviolet-signature mutations and recurrent TP53 and RB1 inactivation. Mod Pathol. 29, 240-248 (2016).
- Abyzov, A., et al. Somatic copy number mosaicism in human skin revealed by induced pluripotent stem cells. Nature. 492, 438-442 (2012).
- Martincorena, I., et al. Tumor evolution. High burden and pervasive positive selection of somatic mutations in normal human skin. Science. 348, 880-886 (2015).
- Su, R. J., Neises, A., Zhang, X. B. Generation of iPS Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors. Methods Mol Biol. 1357, 57-69 (2016).
- Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7, 11-14 (2010).
- Loh, Y. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7, 15-19 (2010).
- Kishino, Y., Seki, T., Yuasa, S., Fujita, J., Fukuda, K. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions. J Vis Exp. , (2015).
- Seki, T., Yuasa, S., Fukuda, K. Generation of induced pluripotent stem cells from a small amount of human peripheral blood using a combination of activated T cells and Sendai virus. Nat Protoc. 7, 718-728 (2012).
- Gill, S., June, C. H. Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies. Immunological reviews. 263, 68-89 (2015).
- Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8, e64496 (2013).
- Li, Y., et al. The p53-PUMA axis suppresses iPSC generation. Nat Commun. 4, 2174 (2013).
- Hardwick, J. M., Youle, R. J. SnapShot: BCL-2 proteins. Cell. 138, 404 (2009).
- Wen, W., et al. Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem Cell Reports. 6, 873-884 (2016).
- Zhang, X. B., et al. Trehalose ameliorates the cryopreservation of cord blood in a preclinical system and increases the recovery of CFUs, long-term culture-initiating cells, and nonobese diabetic-SCID repopulating cells. Transfusion. 43, 265-272 (2003).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. , (2010).
- Castiel, A., et al. Cell death associated with abnormal mitosis observed by confocal imaging in live cancer cells. J Vis Exp. , e50568 (2013).
- Peterson, S. E., et al. Teratoma generation in the testis capsule. J Vis Exp. , e3177 (2011).
- Ritner, C., Bernstein, H. S. Fate mapping of human embryonic stem cells by teratoma formation. J Vis Exp. , (2010).
- Wen, W., et al. Enhanced Generation of Integration-free iPSCs from Human Adult Peripheral Blood Mononuclear Cells with an Optimal Combination of Episomal Vectors. Stem Cell Reports. , (2016).
- Lo, C. A., et al. Quantification of Protein Levels in Single Living Cells. Cell Rep. 13, 2634-2644 (2015).
- Liu, S. P., et al. An improved method for generating integration-free human induced pluripotent stem cells. Zhongguo Shi Yan Xue Ye Xue Za Zhi. 22, 580-587 (2014).
- Luni, C., et al. High-efficiency cellular reprogramming with microfluidics. Nat Methods. 13, 446-452 (2016).
- Chou, B. K., et al. A facile method to establish human induced pluripotent stem cells from adult blood cells under feeder-free and xeno-free culture conditions: a clinically compliant approach. Stem Cells Transl Med. 4, 320-332 (2015).
- Nakagawa, M., et al. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 4, 3594 (2014).
- Howden, S. E., et al. Simultaneous Reprogramming and Gene Correction of Patient Fibroblasts. Stem Cell Reports. 5, 1109-1118 (2015).
- Meng, X., et al. Rapid and efficient reprogramming of human fetal and adult blood CD34+ cells into mesenchymal stem cells with a single factor. Cell research. 23, 658-672 (2013).
- Liao, W., et al. Direct Conversion of Cord Blood CD34+ Cells Into Neural Stem Cells by OCT4. Stem cells translational medicine. 4, 755-763 (2015).
