Efter tvångs uttrycket av flera transkriptionsfaktorer (Dvs. Oct4, Sox2, MYC och Klf4), somatiska celler kan omprogrammeras till inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs), som är mycket lovande för tillämpningar inom regenerativ medicin och cellersättningsterapi ^1-3. Hittills har olika metoder utvecklats för att öka andelen framgångsrika omprogrammering ^4-7. Virala vektorer-inducerade omprogrammering är allmänt används för effektiv generering av iPSCs, eftersom viral integration leder till en hög nivå och stabil expression av de omprogrammering faktorer. Emellertid kan permanent integrering av vektor-DNA i cellgenomet inducera insertionsmutationer ^5. Dessutom kan otillräcklig inaktivering av omprogrammering faktorer störa iPSCs differentiering ^8. Som sådan, är användningen av iPSCs utan integration av omprogrammering faktorer viktigt, speciellt för användning i cellterapi applikationer.

<p class="jove_content"> Episomala vektorer (EO) används i stor utsträckning i generering av integrationsfria iPSCs. Det mest använda EV är en plasmid som innehåller två element, beskärning av viral replikation (oriP) och EB Nuclear Antigen 1 (EBNA1), från Epstein-Barr (EB) -virus ^9. Den oriP elementet främjar plasmid replikation i däggdjursceller, medan EBNA1 elementet binda den oriP-innehållande plasmid DNA till kromosomalt DNA som möjliggör en uppdelning av episom under uppdelningen av värdcellen. I jämförelse med andra integrationsfria metoder, inklusive Sendai-virus (SV) och RNA-transfektion, elbilar har flera fördelar ^5,6,10. Som plasmid-DNA, kan elfordon lätt framställas och modifieras i huset, vilket gör dem extremt prisvärd. Dessutom omprogrammering med EV är en mindre arbetsintensiv process eftersom en enda transfektion med elbilar är tillräcklig för iPSC generation, medan flera RNA-transfektioner är nödvändiga för framgångsrik omprogrammering.

DErmal fibroblaster har använts i många omprogrammering studier. Emellertid är hudbiopsi inte bara en invasiv och smärtsam process, men också tidskrävande för att expandera celler till tillräckliga mängder för omprogrammering. Av större betydelse, har hudceller av vuxna donatorer ofta utsatts för långsiktig UV-strålning, vilket kan leda till mutationer associerade med tumörer, vilket begränsar ansökningarna om iPSCs härrör från hudfibroblaster ^11,12. Nyligen har det rapporterats att normala humana hudceller ansamlas somatiska mutationer och flera cancergener, inklusive de flesta av de viktigaste drivkrafterna för kutan skivepitelcancer, är under stark positiv selektion ^13.

I motsats till hudfibroblaster, perifert blod (PB) celler är en föredragen källa av celler för omprogrammering eftersom 1) blodkroppar kan lätt erhållas genom en minimalt invasiv process, 2) perifera blodceller är avkomman av hematopoietiska stamcellerbosatt i benmärgen, vilket skyddas från skadlig strålning. Perifera mononukleära blodceller (PB MNC) kan samlas i en timme från koncentratskiktet följa en enkel gradient centrifugering med användning av Ficoll-Hypaque (1,077 g / ml). De erhållna PB multinationella består av lymfocyter, monocyter och några hematopoetiska progenitorceller (HPC) ^14. Även om humana T-lymfocyter är en av de huvudsakliga celltyperna i PB, mogna T-celler innehåller omlagringar av T-cellreceptorn (TCR) -gener och saknar en intakt genomet vilket sålunda begränsar deras potential för tillämpningar ^15,16. Emellertid kan föryngring av T-celler via iPSC generation har potentiella tillämpningar inom chimär Antigen Receptor (CAR) T-cellterapi ^17-19. I jämförelse, HPC har en intakt genom och är lätt omprogrammerbara. Även om endast 0,01-0,1% celler i perifera cirkulationen är HPC, kan dessa celler utökas ex vivo i erytroid medium som gynnar spridningen av erythrOID progenitorceller ^14.

I vår tidigare studie använde vi faktor BCL-XL utöver Yamanaka faktorer (Oct4, Sox2, MYC och Klf4), vilket resulterade i en ökning av PB omprogrammering verkningsgrad ²⁰ 10x. BCL-XL, även känd som BCL2L1, är en potent hämmare av celldöd, genom att hämma aktivering av caspaser ^21,22. Men, kan BCL-XL också spela en viktig roll för att upprätthålla pluripotens ^21,22. Nyligen har vi ytterligare optimerat vår EV omprogrammering systemet genom att separat uttrycka MYC och Klf4 med två vektorer, vilket leder till en ungefär 100x ökning av omprogrammering effektivitet ^23. Med användning av denna metod, omprogrammeringen effektivitet, definierat av koloniantal dividerat med utgångscellantalet vid transfektion, är från 0,2 till 0,5% från friska donatorer. Enligt följande, beskriver vi den detaljerade experimentella förfarandet för generering av integrationsfria iPSCs från PB.