После принудительного экспрессии некоторых факторов транскрипции (Т.е. Oct4, Sox2, MYC и KLF4), соматические клетки могут быть перепрограммированы в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), которые держат большие перспективы для применения в регенеративной медицине и клеточной заместительной терапии ^1-3. На сегодняшний день различные методы были разработаны , чтобы увеличить вероятность успеха перепрограммирования ^4-7. Вирусные векторы-индуцированные перепрограммирование широко используется для эффективной генерации ИПСК, так как вирусная интеграция приводит к высокого уровня, стабильной экспрессии факторов перепрограммирования. Тем не менее, постоянная интеграции вектора ДНК в геном клетки может индуцировать инсерционного мутагенеза ^5. Кроме того, недостаточная инактивация факторов перепрограммирования может нарушить ИПСК дифференциации ^8. Таким образом, использование ИПСК без интеграции факторов перепрограммирования крайне важно, особенно для использования в приложениях клеточной терапии.

<p class="jove_content"> Эписомальные векторы (электромобили) широко используются при генерации интеграции свободных ИПСК. Наиболее часто используемым EV представляет собой плазмиду , содержащую два элемента, происхождения вирусной репликации (oriP) и EB ядерному антигену 1 (EBNA1) из вируса ⁹ Эпштейна-Барр (EB). Элемент oriP способствует репликации плазмиды в клетках млекопитающих, в то время как элемент EBNA1 в oriP тросов, содержащих ДНК плазмиды к хромосомной ДНК, что позволяет для разбиения эписома во время деления клетки-хозяина. По сравнению с другими интеграционными свободные подходы, в том числе вирус Сендай (SV) и РНК – трансфекции, электромобили обладают множеством преимуществ ^5,6,10. Как ДНК плазмиды, электромобили могут быть легко получены и модифицированы в доме, что делает их чрезвычайно доступным. Кроме того, перепрограммирование с EV является менее трудоемким процессом, так как одна трансфекция электромобили достаточна для генерации иПСК, в то время как несколько РНК трансфекцию необходимы для успешного перепрограммирования.

DErmal фибробласты были использованы во многих исследованиях перепрограммирования. Тем не менее, биопсия кожи является не только инвазивные и болезненный процесс, но и отнимает много времени для расширения клеток в количествах, достаточных для перепрограммирования. Еще большее беспокойство, клетки кожи взрослых доноров часто подвергаются длительному УФ светового излучения, что может привести к мутациям , связанных с опухолями, ограничивая таким образом приложения для ИПСК , полученных из фибробластов кожи ^11,12. В последнее время , было сообщено , что нормальные клетки кожи человека накапливаются соматические мутации и множественные гены рака, в том числе большинство из ключевых факторов кожными плоскоклеточного рака, находятся под сильным положительным ¹³ выбора.

В отличие от фибробластов кожи, периферической крови (PB) клетки являются предпочтительным источником клеток для перепрограммирования, так как 1) клетки крови могут быть легко получены с помощью минимально инвазивного процесса, 2) клеток периферической крови являются потомством гемопоэтических стволовых клетокпроживающих в костном мозге, таким образом, защищен от вредного излучения. Мононуклеарные клетки периферической крови (PB МНК) могут быть собраны в часе езды от охристо слоя покрытия следующим простым градиентного центрифугирования с использованием Ficoll-Hypaque (1,077 г / мл). Полученные МНК PB состоят из лимфоцитов, моноцитов и нескольких гемопоэтических клеток – предшественников (HPCS) ^14. Хотя человеческие Т – лимфоциты являются одним из основных типов клеток в ПБ, зрелые Т – клетки содержат перегруппировок клеточного рецептора Т (TCR) генов и не имеют неповрежденный геном , таким образом ограничивая их потенциал для применения ^15,16. Тем не менее, омоложение Т – клеток с помощью генерации иПСК может иметь потенциальное применение в химерный антиген рецептор (CAR) Т-клеточной терапии ^17-19. Для сравнения, HPCS имеют неповрежденный геном и легко перепрограммируемой. Хотя только 0,01 – 0,1% клеток в периферическом кровотоке являются HPCS, эти клетки можно размножить в естественных условиях ех эритроидного среде , что способствует пролиферации erythrOID клетки – предшественники ^14.

В нашем предыдущем исследовании мы использовали фактор Bcl-XL в дополнение к факторам Яманака (Oct4, Sox2, MYC и Klf4), что привело к 10 – кратным увеличением PB перепрограммирования Efficency ^20. BCL-XL, также известный как BCL2L1, является мощным ингибитором гибели клеток, путем ингибирования активации каспазы ^21,22. Но, BCL-XL также может играть важную роль в поддержании плюрипотентности ^21,22. В последнее время мы дополнительно оптимизировать нашу систему EV перепрограммирования путем раздельного выражения MYC и Klf4 с двумя векторами, что приводит к приблизительно 100x повышению эффективности перепрограммирования ^23. С помощью этого метода, эффективность перепрограммирования, определяется числом колоний, деленной на число клеток, начиная при трансфекции, составляет 0,2 – 0,5% от здоровых доноров. Как следует, мы опишем подробную экспериментальную процедуру для генерации интеграции свободных ИПСК из PB.