Após expressão forçada de vários factores de transcrição (Ie OCT4, SOX2, MYC e KLF4), células somáticas podem ser reprogramadas para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), que detêm grande promessa para aplicações em medicina regenerativa e terapia de reposição celular ^1-3. Até à data, diversos métodos foram desenvolvidos para aumentar a taxa de sucesso de reprogramação ^4-7. vectores virais induzida por reprogramação é amplamente utilizado para a produção eficiente de iPSCs, pois a integração virai conduz a um alto nível, a expressão estável dos fatores de reprogramação. No entanto, a integração permanente do ADN do vector no genoma da célula pode induzir a mutagénese de inserção ^5. Além disso, a inativação insuficiente de fatores de reprogramação pode perturbar iPSCs diferenciação ^8. Como tal, a utilização de iPSCs sem integração dos factores de reprogramação é imperativo, especialmente para uso em aplicações de terapia celular.

<p class="jove_content"> Episs�ica Vetores (EVs) são amplamente utilizados na geração de iPSCs livre de integração. O EV mais usado é um plasmídeo que contém dois elementos, origem de replicação viral (oriP) e EB Nuclear Antigen 1 (EBNA 1), a partir do vírus de Epstein-Barr (EB) ^9. O elemento oriP promove a replicação do plasmídeo em células de mamíferos, enquanto que o elemento EBNA1 amarras o DNA do plasmídeo que contém oriP ao ADN cromossómico que permite a compartimentação do epissoma durante a divisão da célula hospedeira. Em comparação com outras abordagens livre de integração, incluindo vírus Sendai (SV) e transfecção RNA, EVs possuem várias vantagens ^5,6,10. Como DNA plasmídeo, EVs podem ser facilmente produzida e modificada em casa, tornando-os extremamente acessível. Além disso, a reprogramação com EV é um menor processo trabalhoso já que um único transfecção com EVs é suficiente para a geração de iPSC, enquanto vários transfections RNA são necessários para a reprogramação.

Dfibroblastos ermal têm sido utilizados em vários estudos de reprogramação. No entanto, a biópsia de pele não é apenas um processo invasivo e doloroso, mas também demorado para expansão de células a quantidades suficientes para a reprogramação. De maior preocupação, as células da pele de doadores adultos frequentemente ter sido exposto à radiação de luz UV de longo prazo, o que pode conduzir a mutações associadas a tumores, o que limita as aplicações de iPSCs derivadas a partir de fibroblastos da pele ^11,12. Recentemente, foi relatado que as células de pele humanas normais acumulam mutações somáticas e múltiplos genes do cancro, incluindo a maioria dos principais motores de carcinomas de células escamosas cutâneas, estão sob forte seleção positiva ^13.

Em contraste com os fibroblastos da pele, células do sangue periférico (PB) são uma fonte preferida de células de reprogramação porque 1) as células de sangue podem ser facilmente obtidas através de um processo minimamente invasiva, 2) as células do sangue periférico são a progénie de células estaminais hematopoiéticasresidem na medula óssea, assim, protegido contra a radiação prejudicial. células mononucleares do sangue periférico (PB MNCs) pode ser coletado em uma hora a partir da camada de revestimento de Buffy na sequência de uma centrifugação de gradiente simples usando Ficoll-Hypaque (1.077 g / mL). As EMNs PB obtidos são compostos de linfócitos, monócitos e algumas células progenitoras hematopoiéticas (HPCs) ^14. Embora os linfócitos T humanos são um dos principais tipos de células em PB, as células T maduras contêm rearranjos do receptor de células T (TCR) e os genes não têm um genoma intacto limitando assim o seu potencial para aplicações ^15,16. No entanto, o rejuvenescimento das células T através da geração iPSC pode ter aplicações potenciais em quimérico Antigen Receptor (CAR) terapia com células T ^17-19. Em comparação, HPCs tem um genoma intacto e estão prontamente reprogramável. Apesar de apenas 0,01-0,1% das células em circulação periférica são HPCs, estas células podem ser expandidas ex vivo, em meio de eritróide que favorece a proliferação de erythrcélulas progenitoras oid ^14.

Em nosso estudo anterior, foi utilizado o fator de BCL-XL além dos fatores de Yamanaka (OCT4, SOX2, MYC e KLF4), o que resultou em um aumento de 10x na PB reprogramação efficency ^20. BCL-XL, também conhecido como BCL2L1, é um inibidor potente da morte celular, por inibição da activação de caspases ^21,22. Mas, a BCL-XL também podem desempenhar um papel importante na manutenção da pluripotência ^21,22. Recentemente, temos aperfeiçoado ainda mais nosso sistema EV reprogramação expressando separadamente MYC e KLF4 com dois vectores, o que leva a um aumento de aproximadamente 100 vezes na eficiência da reprogramação ^23. Usando este método, a eficiência de reprogramação, definido pelo número de colónias a partir dividido pelo número de células na transfecção, é 0,2-0,5% de dadores saudáveis. Como se segue, descrevemos o procedimento experimental detalhado para gerar iPSCs livre de integração de PB.