Etter tvunget uttrykk for flere transkripsjonsfaktorer (Dvs. OCT4, SOX2, MYC og KLF4), kan somatiske celler omprogrammeres til indusert Pluripotent stamceller (iPSCs), som holder store løftet for applikasjoner i regenerativ medisin og celle replacement therapy ^1-3. Hittil har ulike metoder blitt utviklet for å øke suksessraten for omprogrammering ^4-7. Virale vektorer-indusert omprogrammering er mye brukt for effektiv generering av iPSCs, fordi viral integrering fører til et høyt nivå, stabil ekspresjon av de reprogrammerings-faktorer. Imidlertid kan permanent integrering av vektor DNA i cellegenomet indusere insertional mutagenese ^5. I tillegg kan utilstrekkelig inaktivering av reprogrammerings faktorer forstyrrer iPSCs differensiering ^8. Som sådan, er bruken av iPSCs uten integrering av reprogrammerings faktorer avgjørende, spesielt for bruk i celleterapi anvendelser.

<p class="jove_content"> Episomale vektorer (elbiler) er mye brukt i produksjon av integrasjonsfritt iPSCs. Den mest brukte EV er et plasmid inneholdende to elementer, opprinnelse på viral replikasjon (oriP) og EB Nuclear antigen 1 (EBNA1), fra Epstein-Barr (EB) virus ^9. Den oriP element fremmer plasmid replikasjon i pattedyrceller, mens den EBNA1 element platformer den oriP-inneholdende plasmid-DNA til kromosomalt DNA som gjør det mulig for oppdeling av episom under delingen av vertscellen. I forhold til andre integrasjonsfrie tilnærminger, inkludert Sendai Virus (SV) og RNA transfeksjon, elbiler har flere fordeler ^5,6,10. Som plasmid DNA, kan elbiler lett produsert og endret i huset, noe som gjør dem svært rimelig. I tillegg omprogrammering med EV er en mindre arbeidskrevende prosess, siden en enkelt transfeksjon med el-biler er tilstrekkelig for IPSC generasjon, mens flere RNA-transfeksjoner er nødvendig for vellykket omprogrammering.

Dermal fibroblaster er blitt anvendt i mange studier omprogrammering. Imidlertid er huden biopsi ikke bare en invasiv og smertefull prosess, men også tidkrevende for å utvide cellene til tilstrekkelige mengder for omprogrammering. Av større interesse er det hudceller hos voksne givere ofte vært utsatt for langvarig UV-lysstråling, som kan føre til mutasjoner assosiert med tumorer, og dermed begrense søknadene for iPSCs avledet fra hudfibroblaster ^11,12. Nylig har det blitt rapportert at normale menneskelige hudceller samle somatiske mutasjoner og flere kreftgener, inkludert de fleste av de viktigste driverne av kutane plateepitelkarsinom, er under sterk positiv seleksjon ^13.

I motsetning til hudfibroblaster, perifert blod (PB) -celler er en foretrukket kilde for celler for omprogrammering fordi 1) blodlegemer kan lett oppnås ved en minimalt invasiv prosess, 2) perifere blodceller er avkommet av hematopoetiske stamcellerbosatt i benmargen, og dermed beskyttet mot skadelig stråling. Perifere blod mononukleære celler (MNC) PB kan samles i en time fra buffy coat-lag etter en enkel sentrifugering ved hjelp av Ficoll-Hypaque (1,077 g / ml). De oppnådde PB MNCer er sammensatt av lymfocytter, monocytter og noen Hematopoetiske progenitorceller (HPCS) ^14. Selv om humane T-lymfocytter er en av de store celletyper i PB, modne T-celler inneholder rearrangementer av T-cellereseptoren (TCR) gener og mangler et intakt genom og dermed begrense deres muligheter for anvendelser ^15,16. Imidlertid kan foryngelse av T-celler via IPSC generasjon har potensielle bruksområder i kimære antigen reseptor (CAR) T-cellen terapi ^17-19. Til sammenligning HPCS har en intakt genom og er lett reprogrammable. Selv om bare 0,01 til 0,1% celler i perifer sirkulasjon er HPCS, kan disse cellene bli utvidet ex vivo i erytroide medium som favoriserer spredning av erythrOID stamceller ^14.

I vår forrige undersøkelse, brukte vi den faktoren BCL-XL i tillegg til de Yamanaka faktorer (OCT4, SOX2, MYC og KLF4), noe som resulterte i en 10x økning i PB omprogrammering effektivitet ^20. BCL-XL, også kjent som BCL2L1, er en potent hemmer av celledød, ved å inhibere aktivering av kaspaser ^21,22. Men, kan BCL-XL også spille en viktig rolle i å opprettholde pluripotency ^21,22. Nylig har vi ytterligere optimalisert vårt EV omprogrammering system ved separat å uttrykke MYC og KLF4 med to vektorer, noe som fører til en tilnærmet 100 ganger økning i effektivitet omprogrammering ^23. Ved hjelp av denne metoden, omprogrammering effektivitet, definert ved koloni-nummer delt av startcellenummer ved transfeksjon, er 0,2 til 0,5% fra friske donorer. Som følger, beskriver vi den detaljerte eksperimentelle prosedyren for å generere integrering fritt iPSCs fra PB.